安徽省西瓜枯萎病菌遺傳多樣性ISSR—PCR分析

李萍　劉冬　姜曉斌　余碧霞

摘 要：以42株來自安徽省不同地區的西瓜枯萎病菌為試材，采用Inter-simple Sequence Repeats（ISSR）技術對其群體的遺傳多樣性進行分析，探究病菌的遺傳分化與地理來源之間的相關性.結果表明，用篩選出的11個隨機引物對西瓜枯萎病菌菌株進行ISSR-PCR擴增，共獲得129個ISSR條帶，其中多態性條帶為94個，占72.9%，表明安徽省西瓜枯萎病菌存在較豐富的遺傳多樣性，菌株間的遺傳相似系數為0.71～0.97.UPGMA聚類分析顯示，供試菌株可區分為8個聚類組，菌株的遺傳譜系與地理來源無相關性.

關鍵詞：西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. niveum）；ISSR-PCR；遺傳多樣性

[中圖分類號]S436.5 [文獻標志碼]A

Abstract：In order to probe into the relationship between genetic diversity and geographical origin among isolates of Fusarium oxysporum f. sp. nevium from Anhui Province in eastern China， inter-simple sequence repeat-polymerase chain reaction （ISSR-PCR） was conducted to investigate the genetic diversity of 42 isolates of F. oxysporum f. sp. nevium. The result showed that 11 random primers which produced reproducible fragments were screened， generated a total of 129 ISSR fragments， of which 72.9% （94） were polymorphic， revealing high polymorphism among the isolates. Genetic similarity coefficients among all of the isolates ranged from 0.71 to 0.97. Cluster analysis using the unweighted pair-group method with arithmetic averages （UPGMA） indicated that the Anhui isolates were divided into eight groups according to the DNA fingerprints， and that no correlation between ISSR group and geographical origin.

Key words：Fusarium oxysporum f. sp. niveum； ISSR-PCR； genetic diversity； Anhui

西瓜（Citrullus lanatus）原產于非洲，是世界重要的十大水果之一，現已在我國廣泛栽培，播種總面積達180.15萬公頃，其產值已占蔬菜總產值的10%以上.[1]西瓜在種植過程中易遭受土傳真菌枯萎病菌的侵染，給瓜農帶來嚴重的經濟損失.1894年，Smith首次報道由尖孢鐮刀菌西瓜專化型[Fusarium oxysporum Schl. f.sp. niveum （ E.F. Smith） Snyder et Hansen]引起的西瓜枯萎病，該病現廣泛分布于非洲、澳大利亞、亞洲、歐洲、北美和南美等國家[2]，是一種世界性毀滅性的土傳病害.

尖孢鐮刀菌易變異與多型性的特性，是西瓜枯萎病菌專化型分化及生理小種分化的重要原因.研究西瓜枯萎病菌的遺傳多樣性對于有效控制田間西瓜枯萎病非常必要.目前關于遺傳多樣性檢測技術的報道較多[3]，其中ISSR技術簡便可靠、DNA樣品用量少、實驗成本低、信息量大，已廣泛用于動植物和病原真菌遺傳多樣性的研究.研究表明，ISSR技術比RFLP、SSR和RAPD具有更高的多態性.[4]目前，關于安徽省西瓜枯萎病菌群體遺傳多樣性未見報道.本研究擬使用ISSR-PCR技術，分析安徽省不同地區西瓜枯萎病菌的遺傳結構，探明不同地區西瓜枯萎病菌群體遺傳變異特性，探討指紋圖譜與地理來源的相關性，為抗病品種的合理布局和殺菌劑的有效施用提供理論依據.

1 材料與方法

1.1 供試菌株

2016-2017年，從安徽省六安、鳳臺、安慶、碭山、肥東等縣市采集西瓜枯萎病病株，采用組織分離法分離，經純化共獲得42株西瓜枯萎病菌作為供試菌株.各菌株的采集地、擴增條帶數和基因型見表1.

1.2 西瓜枯萎病菌基因組DNA提取

將供試菌株在PDA培養基上培養3 d后，沿菌落邊緣用直徑為7 mm的打孔器打取菌碟，轉移至三角瓶中.三角瓶裝PDB培養液100 mL，25 ℃、搖床振蕩（100 r/min）培養7 d.用雙層滅菌紗布過濾得到菌絲體，使用CTAB 法提取基因組 DNA[5]，置于-20 ℃冰箱中保存備用.

1.3 西瓜枯萎病菌ISSR-PCR分析

1.3.1 ISSR-PCR引物的篩選

從供試菌株中隨機選取10個菌株，以其DNA為模板，用40個引物對其進行擴增，篩選出擴增條帶清晰、重復性好、多態性高的ISSR引物.引物編號、序列和退火溫度見表2.

1.3.2 ISSR-PCR分析

ISSR-PCR 擴增反應采用25 μl反應體系.反應組分包括：12.5 μL 2×Taq Plus PCR MasterMix，1.0 μL 引物，10 ng 模板DNA，加無菌超純水至25 μL.PCR 反應參數： 94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，50～60 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃ 保存備用.每個引物均對受試菌株重復擴增3次，每次反應均設不加模板的空白對照.擴增產物用1.8%瓊脂糖凝膠電泳，100 V電泳2～3 h，用0.5 μg·mL-1溴化乙錠溶液染色，紫外燈下觀察并用凝膠成像系統照相.

1.4 數據分析

記錄電泳結果，參考孫玉友和孫玉剛[3]報道的方法，用NTSYS-pc 2.1軟件計算菌株間的遺傳相似系數，進行UPGMA聚類分析，構建菌株的親緣關系樹狀圖.

2 結果與分析

2.1 PCR擴增結果分析

篩選出擴增條帶清晰、結果穩定、多態性好的11個引物，對安徽省西瓜枯萎病菌菌株進行ISSR-PCR分析，并確定每個引物的最佳退火溫度.擴增結果表明，不同引物擴增的條帶數不同，其中引物ILE120擴增的條帶最少為8條.引物UBC835擴增的條帶數最多，達14條.平均每個引物擴增的條帶數為11.6條.多態性條帶數94條，占擴增總帶數的72.9%.圖1為引物ILE131擴增的DNA指紋圖譜.

2.2 ISSR聚類分析

采用NTSYS-pc 2.1生物軟件對安徽省西瓜枯萎病菌進行UPGMA聚類分析，結果見圖2.圖2的結果表明，用11個引物擴增的菌株的遺傳背景不全相同，42株西瓜枯萎病菌菌株間的遺傳相似系數為0.71～0.97.以遺傳相似系數0.81為閾值，供試菌株被劃分為8個遺傳聚類組.其中，居群1分為5個組（A，B，C，E和F），大部分歸為A組，占72.7%；居群2分為4個組（A，C，D和G），大部分歸為D組，占61.5%；居群3分為4個組（A，B，C和D），大部分歸為D組，占68.8%.從聚類圖中可以看出，來自相同地區的大部分菌株聚為一類，菌株的聚類與菌株的采集年份無關.來自合肥的3個菌株基因型為E，來自安慶的1個菌株基因型為F，來自于銅陵的1個菌株基因型為G.淮南的8個菌株、合肥的2個菌株、巢湖的2個菌株、安慶的4個菌株、銅陵的1個菌株和阜陽的2個菌株均為基因型A；巢湖的1個菌株、亳州的1個菌株為基因型B；合肥的1個菌株、池州的2個菌株、銅陵的1個菌株、阜陽的1個菌株和亳州的1個菌株均為基因型C；銅陵的8個菌株和亳州的11個菌株為基因型D.因此，來源于一個居群的基因型E，F和G為單源.基因型A和C來源于3個居群，基因型B和D來源于2個居群，表明基因型A，B，C和D為多源的.

3 結論

利用ISSR-PCR技術研究安徽省西瓜枯萎病菌菌株的遺傳多樣性，共獲得129個ISSR條帶，其中多態性條帶為94個，占72.9%，表明安徽省西瓜枯萎病菌存在較豐富的遺傳多樣性，菌株間的遺傳相似系數為0.71～0.97.UPGMA聚類分析顯示，供試菌株可區分為8個聚類組，菌株的遺傳譜系與地理來源無相關性.

安徽省西瓜枯萎病菌群體遺傳多樣性的研究給病害的管理提供了信息，為抗病育種提供了參考.

參考文獻

[1] 《中國蔬菜》編輯部. 全國西瓜主要優勢產區生產現狀（一）[J]. 中國蔬菜， 2011， 1（13）： 5-9.

[2] 劉冬，李萍，畢璋友，等.西瓜枯萎病生物防治技術研究進展[J].信陽農林學院學報，2017，27（3）：82-85.

[3] 孫玉友.利用SRAP分子標記分析栽培稻的遺傳多樣性[J].牡丹江師范學院學報：自然科學版，2012（1）：24-26.

[4] Gilbert JE， Lewis RV， Wilkinson MJ， Caligari PDS. Developing an appropriate strategy to assess genetic variability in plant germplasm collections[J]. Theor Appl Genet 1999， 98：1125-1131.

[5] Liu D， Coloe S， Baird R， et al. Rapid mini-preparation of fungal DNA for PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology， 2000， 38 （1）： 471.

編輯：琳莉