白耙齒菌固體發酵物對慶大霉素所致大鼠急性腎衰竭的改善作用研究

2018-09-10 13:45:01李昂黃靜劉旭步洪石劉馨晨王淑敏

中國藥房 2018年13期

李昂黃靜劉旭步洪石劉馨晨王淑敏

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1772-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.11

摘要目的：研究白耙齒菌固體發酵物對慶大霉素（GM）所致大鼠急性腎衰竭的改善作用。方法：將50只大鼠隨機分為空白對照組、模型組、陽性對照組（尿毒清顆粒，2 g/kg）和白耙齒菌固體發酵物低、高劑量組（2、4 g/kg），每組10只。除空白對照組外，其余各組大鼠均連續7d腹腔注射GM（140 mg/kg）復制急性腎衰竭模型。給藥組大鼠每天在造模2 h后灌胃給藥1次，空白對照組和模型組在相應時間灌胃等量生理鹽水；造模結束后，各組大鼠再連續給藥7 d，每天給藥1次。給藥結束后，檢測大鼠血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、尿肌酐（Ucr）和右腎組織中白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量，蘇木精-伊紅染色后觀察大鼠左腎組織病理學變化。結果：與空白對照組比較，模型組大鼠Scr、BUN、Ucr和右腎組織中IL-6、TNF-α含量均顯著增加（P<0.01）；左腎組織發生腎小管上皮細胞明顯水腫、變性、細胞核消失以及管腔內蛋白樣沉積增多等病理學變化。與模型組比較，陽性對照組大鼠Ucr和白耙齒菌固體發酵物低劑量組大鼠BUN以及白耙齒菌固體發酵物高劑量組大鼠Scr、BUN、Ucr含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）；同時給藥組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）；左腎組織的炎癥浸潤減輕、腎小管和血管的增生受到抑制，病理學變化得到明顯改善。結論：白耙齒菌固體發酵物對GM所致急性腎衰竭具有一定的改善作用。

關鍵詞白耙齒菌；固體發酵物；急性腎衰竭；慶大霉素；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effects of Irpex lacteus solid fermentation products on gentamycin （GM）-induced acute renal failure in rats. METHODS： Fifty rats were randomly divided into blank control group， model group， positive control group （Niaoduqing granule， 2 g/kg） and Irpex lacteus solid fermentation products low-dose and high-dose groups （2， 4 g/kg）， with 10 rats in each group. Except for blank control group， other groups were given GM （140 mg/kg） intraperitoneally for consecutive 7 d to induce acute renal failure model. Administration group was given relevant medicine intragastrically 2 h after modeling， once a day. Blank control group and model group were given constant volume of normal saline at corresponding time. After modeling， each group was given relevant medicine for consecutive 7 d， once a day. After medication， the contents of Scr， BUN， Ucr and IL-6， TNF-α in right renal tissue were detected. The pathological changes of left renal tissue was observed by HE staining. RESULTS： Compared with blank control group， the contents of Scr， BUN， Ucr and IL-6， TNF-α in right renal tissue were increased significantly in model group （P<0.01）. The pathological changes of left renal tissue were observed， such as obvious renal tubular epithelial cell edema， degeneration， nucleus disappearance and the increase of protein-like deposition in the lumen. Compared with model group， the content of Ucr in positive control group and the content of BUN in I. lacteus solid fermentation products low-dose group and the contents of Scr， BUN， Ucr in I. lacteus solid fermentation products high-dose group were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）； meanwhile， the contents of IL-6 and TNF-α in right renal tissue were decreased significantly in administration groups （P<0.05 or P<0.01）. The inflammatory infiltration of left renal tissue was relieved， and renal tubules and vessels hyperplasia were inhibited； the pathological changes were improved significantly. CONCLUSIONS： I. lacteus solid fermentation products could improve GM-induced acute renal failure to certain extent.

KEYWORDS Irpex lacteus； Solid fermentation products； Acute renal failure； Gentamicin； Rats

慶大霉素（Gentamicin，GM）是臨床常用的抗感染藥物，因其以原型由腎排泄，使藥物大量蓄積在腎皮質[1-3]，這不僅增加了治療的風險，也限制了GM 的臨床應用。GM易引起腎損傷與功能性障礙，在所致腎損傷過程中，有大量促炎因子和趨化因子參與，并伴隨炎癥反應的發生。白耙齒菌（Irpex lacteus）又名白囊耙齒菌，屬于多孔菌目（Polyporales）皺孔菌科（Meruliaceae）耙齒菌屬（Irpex）的一種藥用真菌，生于闊葉樹的枯立木、枯枝上，民間常用于治療腎小球腎炎[4-5]。由于白耙齒菌在修復腎小球炎性損傷方面具有較好的功效，故本研究擬通過大鼠連續7 d腹腔注射GM建立急性腎衰竭模型，研究白耙齒菌固體發酵物對急性腎衰竭的改善作用，為白耙齒菌臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

AUY220型精密電子天平（日本島津公司）；TGL16M型臺式高速冷凍離心機（湖南凱大科學儀器有限公司）；CX31型生物顯微鏡（上海奮業光電儀器設備有限公司）；FLUOstar Omega型全自動多功能酶標儀（廣州伯齊科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

尿毒清顆粒（廣州康晨藥業有限公司，批號：20150419，規格：5 g/包，給藥前用生理鹽水分散）；硫酸慶大霉素注射液（河南潤弘制藥股份有限公司，批號：1603101，規格：2 mL ∶ 4萬單位）；血肌酐（Scr）、血尿素氮（BUN）、尿肌酐（Ucr）試劑盒和白細胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：均為20160906）。

1.3 動物

健康清潔級SD大鼠50只，♂，體質量180～220 g，由遼寧生物制品有限責任公司提供，動物生產合格證號：SCXK（遼）2015-0001。動物飼養觀察環境的溫度為24～25 ℃，濕度為（60±10）%。

1.4 菌株

白耙齒菌CZ-81保存于長春中醫藥大學菌物藥研究室。

2 方法

2.1 白耙齒菌固體發酵物的制備

將薏米和麥麩以2 ∶ 1的質量比混合，滅菌后制成培養基。將白耙齒菌CZ-81接種于培養基上，25 ℃條件下培養，待其長滿培養基后，烘干，粉碎，即得（給藥前用生理鹽水分散）。

2.2 分組、造模與給藥

將大鼠適應性飼養1周后隨機分為5組，分別為空白對照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性對照組（尿毒清顆粒，2 g/kg，為臨床用量的等效劑量）和白耙齒菌固體發酵物低、高劑量組[2、4 g/kg，根據臨床益腎康膠囊（白耙齒菌液體發酵物的出膏率約40%）服用量（1.2～1.8 g/d）換算而得]，每組10只。除空白對照組大鼠注射生理鹽水外，其余各組大鼠均每天腹腔注射GM（140 mg/kg）1次，連續注射7 d，制備急性腎衰竭模型[6-10]。每天在注射GM 2 h后，灌胃給藥，連續給藥7 d。在造模結束后，大鼠再連續給藥7 d，共給藥14 d。

2.3 標本采集

在實驗第13天，大鼠禁食不禁水24 h，收集大鼠尿液，記錄尿量。在實驗第14天，給藥4 h后用水合氯醛將大鼠麻醉，腹主動脈取血，將血液在4 ℃ 條件下以4 037×g離心10 min，取血清備用。取血后將大鼠處死，迅速取兩側全腎，左腎固定在10%中性福爾馬林中，備用。所有尿液、血清和右腎樣本均置于-80 ℃冰箱中凍存，待檢。

2.4 生化指標檢測

取血清，采用苦味酸比色法測定其中Scr含量，二乙酰肟法測定其中BUN含量；取尿液，采用苦味酸比色法測定其中Ucr含量；取右腎制成10%腎皮質勻漿，ELISA法測定腎組織中IL-6、TNF-α含量。以上操作均按照相應試劑盒說明書進行。

2.5 腎組織病理學觀察

取用10%中性福爾馬林固定24 h后的左腎組織，常規石蠟包埋切片（厚度4 ?m），用二甲苯脫蠟，梯度乙醇漂洗，切片用蘇木精-伊紅（HE）染色，然后在顯微鏡下觀察腎組織病理變化。

2.6 統計學方法

采用GraphPad prism 5統計學軟件進行數據處理。數據以x±s表示，采用單因素方差分析，方差齊性組間比較采用LSD檢驗，方差不齊時采用秩和檢驗進行組間比較。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠生化指標測定結果

與空白對照組比較，模型組大鼠Scr、BUN、Ucr含量均顯著增加（P<0.01）；與模型組比較，陽性對照組大鼠Ucr和白耙齒菌固體發酵物低劑量組大鼠BUN以及白耙齒菌固體發酵物高劑量組大鼠Scr、BUN、Ucr含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠Scr、BUN、Ucr含量測定結果見表1。

3.2 右腎組織中IL-6、TNF-α含量測定結果

與空白對照組比較，模型組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量顯著增加（P<0.05）；與模型組比較，陽性對照組和白耙齒菌固體發酵物低、高劑量組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量均顯著減少（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠右腎組織中IL-6、TNF-α含量測定結果見表2。

3.3 病理學觀察結果

與空白對照組比較，模型組大鼠左腎組織病變非常明顯，腎小管上皮細胞具有明顯的病變、水腫、變形或細胞核消失癥狀，而且小血管高度擴張，管腔內蛋白樣沉積物增多，腎小管有壞死并伴有間質纖維化程度加深，腎間質炎性細胞有灶性浸潤。與模型組比較，陽性對照組大鼠左腎組織病理病變不明顯，偶見腎小管上皮細胞水腫和變形；白耙齒菌固體發酵物低劑量組大鼠腎小管擴張不明顯，腎間質出現少量炎癥浸潤，改善效果明顯；白耙齒菌固體發酵物高劑量組大鼠血管擴張不明顯，未見腎小管上皮細胞明顯水腫、變形，改善效果要優于陽性對照組。各組大鼠左腎組織病理切片見圖1。

4 討論

模型組大鼠連續7 d腹腔注射GM后，尿量呈上升趨勢，Scr、BUN、Ucr的含量均增加，與空白對照組比較差異有統計學意義（P<0.01）。其中，Scr和BUN含量是衡量腎功能正常與否的重要指標。本研究結果提示，模型大鼠的腎小球濾過功能和腎小管重吸收功能同時受損，這與文獻報道的GM可引起大鼠非少尿型的急性腎衰竭一致[8]，證明模型建立成功。白耙齒菌固體發酵物高劑量組大鼠Scr、BUN、Ucr的含量比模型組顯著降低（P<0.05），提示白耙齒菌固體發酵物具有減輕腎小球和腎小管功能受損的作用。病理結果也顯示，給予白耙齒菌發酵物后模型大鼠腎間質炎性細胞灶性浸潤減輕，白耙齒菌發酵物高劑量組大鼠未見腎小管上皮細胞明顯水腫、變形。同時，給藥組大鼠腎組織中的炎癥因子IL-6和TNF-α的含量比模型組明顯降低（P<0.05或P<0.01）。由此可以說明，白耙齒菌固體發酵物可有效抑制腎組織炎癥反應，具有抑制腎損傷的作用，可用于防治急性腎衰竭。

中成藥尿毒清顆粒是臨床用于治療腎衰竭的常用藥物，適用于氮質血癥期、尿毒癥早期以及中醫辨證屬脾虛濕濁癥和脾虛血瘀癥者，可降低Scr、BUN含量和穩定腎功能、減少蛋白尿的排泄、抑制腎小管上皮細胞表型轉化、延緩腎纖維化等[11-13]，因此本研究以其為陽性對照藥。從本研究結果可以看出，不管是Scr、BUN、Ucr的含量，還是腎組織中炎癥因子IL-6和TNF-α的含量，白耙齒菌固體發酵物組大鼠的變化均優于給予尿毒清顆粒的陽性對照組，尤其是白耙齒菌固體發酵物高劑量組。本實驗中有的實驗組存在組間數據偏差過大的情況，這可能是由于大鼠個體差異帶來的異常值。

綜上所述，白耙齒菌固體發酵物在治療氨基糖苷類抗生素（如GM）所致的急性腎衰竭方面具有開發價值，本研究為今后白耙齒菌固體發酵物的臨床應用奠定了基礎，也為保腎藥物的研發提供了科學依據。

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