救必應胃痛片的HPLC指紋圖譜研究

蔣秋香 韋雪丹 莫海彥 黎理 蔡毅 馬妍

中圖分類號 R284.1 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1786-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.14

摘 要 目的：建立救必應胃痛片的指紋圖譜，為完善其質量控制提供參考。方法：采用高效液相色譜法建立13批救必應胃痛片的指紋圖譜，采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統》（2012年版）對生成的指紋圖譜進行分析，并以方中3種藥材（木香、肉桂和陳皮）提取液為對照對各共有峰進行歸屬。結果：13批救必應胃痛片指紋圖譜的相似度均大于0.952，共確定了12個共有色譜峰，并指認了其中3、4、10、12號共有色譜峰分別為橙皮苷、桂皮醛、木香烴內酯、去氫木香烴內酯。其中，2、3、5、8、9、11號共有色譜峰歸屬于陳皮藥材，10、12號共有色譜峰歸屬于木香藥材，1、4、6、7號共有色譜峰歸屬于肉桂藥材。結論：本研究為救必應胃痛片的質量控制提供了一定的試驗依據。

關鍵詞 救必應胃痛片；高效液相色譜法；指紋圖譜

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish fingerprint for Jiubiying weitong tablets， and to provide reference for improving quality control of it. METHODS： The fingerprints for 13 batches of Jiubiying weitong tablets were established by HPLC. Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of TCM （2012 edition） was used to analyze fingerprint. The attribution of common peaks were assigned by using 3 kinds of medicinal materials （Aucklandia lappa， Cinnamomum cassia and Citrus reticulata） extracts as reference. RESULTS： The similarity of 13 batches of Jiubiying weitong tablets was higher than 0.952， and 12 common chromatographic peaks were observed. No. 3， 4， 10 and 12 common chromatographic peaks were hesperidin， cinnamaldehyde， costuslactone and dehydrocostuslactone， respectively. No. 2， 3， 5， 8， 9， 11 common chromatographic peaks were attributed to C. reticulate； No. 10 and 12 common chromatographic peaks were attributed to A. lappa； No. 1， 4， 6， 7 common chromatographi peaks were attributed to C. cassia. CONCLUSIONS： The study provide certain evidence for quality control of Jiubiying weitong tablets.

KEYWORDS Jiubiying weitong tablets； HPLC； Fingerprint

救必應胃痛片由木香、救必應、高良姜、肉桂、陳皮、甘草流浸膏、碳酸氫鈉和三硅酸鎂等組成，具有鎮痛、解痙、制酸、健胃等功效，用于胃、十二指腸潰瘍和慢性胃炎屬肝胃不和證者[1]。救必應胃痛片的現行版質量標準為國家食品藥品監督管理局頒布的WS-10593（ZD- 0593）-2002-2012Z，其項下有3個化學反應鑒別項，用于鑒別處方中的碳酸氫鈉、三硅酸鎂；3個薄層色譜鑒別項，用于鑒別橙皮苷、桂皮醛和木香；3個含量測定項，用于測定橙皮苷、碳酸氫鈉和三硅酸鎂的含量。但是中成藥中各藥材的化學成分繁多且復雜，不同的成分表現出不同的藥效，建立其質量控制方法頗為困難。目前，中藥指紋圖譜研究是國際上公認且有效的中藥質量控制方法[2]。筆者擬進行探索性研究，建立救必應胃痛片的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，測定13批次救必應胃痛片樣品的相關數據，采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統》（2012年版）對圖譜和數據進行分析處理和相似度評價，以期為控制該制劑質量的穩定性和優良性提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

1525型HPLC儀（美國Waters公司）；AE200型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；AS7240BT型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

救必應胃痛片[廣西圣特藥業有限公司，規格：0.36 g/片，批號：131001、131101、140101、140102、140301、140601、141101、150101、150301、150601、151001、151201、160101，上述13批樣品按批號依次簡稱為S1～S13]；木香烴內酯（批號：111524-200503）、去氫木香烴內酯（批號：111525-200505）、桂皮醛（批號：110710- 201418）、橙皮苷（批號：110721-200512）對照品和肉桂（批號：121363-200401）、陳皮（批號：120969-200507）、木香（批號：120921-201309）對照藥材均來源于中國食品藥品檢定研究院（其中對照品純度：均>99.0%）；甲醇為色譜純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流動相：甲醇（A）-水（B）（梯度洗脫：0～30 min，30%→45%A；30～70 min，45%→75%A）[3-6]；檢測波長：0～30 min為283 nm，30～70 min為225 nm；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取木香烴內酯對照品10.32 mg、去氫木香烴內酯對照品10.09 mg，分別置于100 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對照貯備液A、B；精密稱取桂皮醛對照品15.49 mg、橙皮苷對照品15.30 mg，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對照貯備液C、D；分別精密吸取上述對照貯備液A、B、C各1 mL和對照貯備液D 2 mL，置于同一10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，搖勻，即得木香烴內酯質量濃度為10.32 μg/mL、去氫木香烴內酯質量濃度為10.09 μg/mL、桂皮醛質量濃度為30.79 μg/mL和橙皮苷質量濃度為61.20 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取研細的救必應胃痛片樣品0.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）20 min，放冷，再次稱定質量，用90%甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得[7-8]。

2.2.3 3種對照藥材提取液 分別取木香、肉桂和陳皮3種中藥材適量，粉碎，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）20 min，放冷，再次稱定質量，用90%甲醇補足減失質量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得。

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性試驗 取“2.2”項下的混合對照品溶液、供試品（批號：140101）溶液和3種對照藥材提取液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。結果顯示，各個色譜峰間均能達到基線分離，分離度均大于1.5，表明該方法專屬性較好。

2.3.2 精密度試驗 取同一供試品（批號：140101）溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜。以3號峰橙皮苷為參照峰S，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各特征峰相對保留時間的RSD為0.06%～0.20%（n=6），相對峰面積的RSD為0.37%～2.13%（n=6），表明該方法精密度良好[9-10]。

2.3.3 重復性試驗 精密稱取同一批次救必應胃痛片樣品（批號：140101）6份，按“2.2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。以3號峰橙皮苷為參照峰S，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各特征峰相對保留時間的RSD為0.08%～0.27%（n=6），相對峰面積的RSD為0.27%～2.88%（n=6），表明該方法的重復性良好[9-10]。

2.3.4 穩定性試驗 取同一供試品（批號：140101）溶液，室溫放置0、2、4、8、12、24 h后分別按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜。以3號峰橙皮苷為參照峰S，計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示，各特征峰相對保留時間的RSD為0.06%～0.31%（n=6），相對峰面積的RSD為0.50%～2.76%（n=6），表明該供試品溶液在24 h內穩定性良好[9-10]。

2.4 HPLC指紋圖譜研究

2.4.1 指紋圖譜的生成及相似度、共有峰分析 取13批救必應胃痛片樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液。分別取混合對照品溶液、供試品溶液和3種對照藥材提取液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，并記錄色譜圖。采用《中藥指紋圖譜相似度評價系統》（2012年版）對HPLC圖譜進行分析處理，以批號為140101的救必應胃痛片的圖譜為參照，經過多點校正、自動匹配，采用均值法生成對照指紋圖譜R并進行相關分析。結果顯示，共得到12個共有色譜峰，各共有色譜峰與對照指紋圖譜R的相似度均大于0.952，并指認了其中3號共有色譜峰為橙皮苷、4號共有色譜峰為桂皮醛、10號共有色譜峰為木香烴內酯、12號共有色譜峰為去氫木香烴內酯。救必應胃痛片樣品（批號：140101）和混合對照品的HPLC圖見圖1，指紋圖譜見圖2，共有峰的相對保留時間測定結果見表1，共有峰的相對峰面積測定結果見表2（以3號色譜峰為參照），相似度評價結果見表3。

2.4.2 色譜峰的歸屬 取“2.2.3”項下3種對照藥材提取液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，進行色譜峰的歸屬確認。通過與對照圖譜進行比較，確定2、3、5、8、9、11號共有色譜峰歸屬于陳皮藥材，10、12號共有色譜峰歸屬于木香藥材，1、4、6、7號共有色譜峰歸屬于肉桂藥材，3種對照藥材提取液的HPLC圖見圖3。

3 討論

3.1 流動相的選擇

參考2015年版《中國藥典》（一部）[3]中陳皮、桂枝和木香等藥材含量測定項下的流動相條件，并結合相關文獻[4-6]報道，筆者在前期預試驗中以甲醇為流動相A、水為流動相B分別進行了如下梯度洗脫：（1）0～30 min為35%A，30～70 min為65%A；（2）0～20 min為38%A，20～70 min為38%→70%A；（4）0～20 min為38%A，20～50 min為38%→75%A，50～60 min為75%A；（4）0～30 min為30%→45%A，30～70 min為45%→75%A。綜合分析保留時間、理論板數、基線、雜質影響、分離效果等各方面因素，發現方案（4）為最理想的流動相條件，故本研究以此為洗脫條件。

3.2 檢測波長的選擇

通過二級管陣列檢測器（DAD檢測器）在200～600 nm波長范圍內對供試品溶液進行全波長掃描，參考2015年版《中國藥典》（一部）[3]中陳皮、桂枝和木香等藥材含量測定項下的檢測波長，結合實際的試驗操作條件，將0～30 min檢測波長設為283 nm，30～70 min檢測波長設為225 nm。此條件下，圖譜基線平穩、色譜峰較多、峰形較好。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇和優化

在前期研究中，筆者以溶劑體積、甲醇體積分數和提取時間作為考察因素，以去氫木香烴內酯、木香烴內酯、桂皮醛和橙皮苷的得率為考核指標，設計L9（34）正交試驗，對供試品溶液的提取方法進行了優化，得出最優水平組合為使用90%甲醇25 mL超聲處理（功率：250 W，頻率：50 kHz）20 min。此條件下提取的供試品溶液進樣后所得的色譜峰個數較多且峰形較好，且為該條件下測定去氫木香烴內酯、木香烴內酯、桂皮醛和橙皮苷的含量奠定了基礎。

3.4 3種對照藥材選擇的依據

筆者曾按照處方比例自制救必應胃痛片樣品，用于薄層色譜鑒別和HPLC法測定，經過多次不同提取方法、不同展開系統及不同流動相分離的預試驗。結果，薄層板上，救必應對照藥材均能在與對照品紫丁香苷和長梗冬青苷色譜相應的位置出現相同顏色的斑點，且斑點清晰，比移值（Rf）適中，能與雜質分離。然而在供試品及按處方比例自制的樣品中，卻未能出現相應的斑點。HPLC圖中，救必應對照藥材在與對照品紫丁香苷和長梗冬青苷色譜峰的保留時間處出現相應的色譜峰，分離度均大于1.5，且理論板數均大于4 000，然而在供試品及按處方比例自制的樣品中，卻未能出現相應的色譜峰。綜合上述2個試驗結果，故筆者在本研究中未設置救必應藥材對照。對于此結果，筆者分析原因可能為以下兩點：（1）單味藥材的成分較單一，且各成分之間的性質頗為接近，在提取時各成分之間的相互作用較少；（2）救必應藥材中的紫丁香苷和長梗冬青苷均為苷類化合物，苷鍵在酸、堿、酶或氧化的情況下都有可能開裂、水解，與其他幾味藥混合提取后，成分變得復雜，各成分之間的相互作用、相互影響增大，導致目標成分分解或未能提出，最終導致薄層斑點不清晰，液相色譜不出峰。

3.5 指紋圖譜建立的思考

本研究對13批救必應胃痛片樣品進行了HPLC指紋圖譜研究，共生成12個共有峰，并對12個共有峰進行了藥味歸屬，初步闡明了共有峰來源，并通過與對照指紋圖譜對比的方法，將部分色譜峰進行了定性分析。其中，確定2、3、5、8、9、11號峰歸屬于陳皮藥材，指認了3號峰為橙皮苷峰；1、4、6、7號峰歸屬于肉桂藥材，指認了4號峰為桂皮醛峰。在參照色譜峰的選擇上，以3號峰橙皮苷為參照峰S計算各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，是因為橙皮苷峰旁邊無雜質峰干擾、基線平直、出峰時間適當且峰面積大小合適。

筆者曾將0～30 min時流動相中的甲醇體積分數調至20%→45%和40%→65%，發現在不同流動相下4 min處色譜峰保留時間未發生改變，故考慮該峰可能為溶劑峰或流動相峰，因此未將此峰作為共有峰處理。本制劑中含6味中藥材，各藥材成分繁多，種質資源復雜，不同地區采收時間各異，導致藥材含量也各有不同，甚至成分也略有差異，批號為131001的樣品（S1）和批號為1150101的樣品（S8）在68 min處出現色譜峰，而其他12批次在此處未見出峰，這可能與各批次樣品中原藥材的成分差異有關。

從指紋圖譜的相似度來看，13批救必應胃痛片樣品生成的對照指紋圖譜的相似度在0.952～0.999，相似度較高，表明差異較小、穩定性好，比較客觀地體現了該藥中木香、陳皮、肉桂等原藥材產地的穩定性、生產工藝的成熟性和產品內在質量的穩定均一性。然而，對于該復方制劑中其余各成分的結構確定，比如1、2、5、6、7、8、9和11等8個共有色譜峰在本研究中未能得到指認，還需結合其他試驗手段進行深入研究，這將是筆者下一步繼續研究的方向。

參考文獻

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（收稿日期：2017-11-02 修回日期：2018-04-08）

（編輯：林 靜）