錦雞兒總黃酮預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠血腦屏障通透性的影響及機制研究

張亞洲 何前松 胡斐然 樊梓媛

中圖分類號 R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）13-1793-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.13.16

摘 要 目的：研究錦雞兒總黃酮（TFC）預處理對局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠血腦屏障通透性的影響及機制，為其進一步開發和臨床用于治療缺血性腦卒中提供參考。方法：將120只大鼠隨機分為假手術組、模型組、尼莫地平組（陽性對照，12.6 mg/kg）和TFC高、中、低劑量組（60、30、15 mg/kg），每組20只。各給藥組大鼠灌胃相應藥物，假手術組和模型組大鼠灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續7 d。末次灌胃2h后，除假手術組外的其余各組大鼠均采用線栓法復制局灶性腦缺血再灌注損傷模型。再灌注24 h后，進行神經功能缺損評分，采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑染色計算腦梗死面積百分比，分光光度法測定腦組織中伊文思藍含量以考察血腦屏障的通透性；Western blot法檢測腦缺血半暗帶區基質金屬蛋白酶9（MMP-9）、MMP-2和血腦屏障緊密連接相關蛋白Claudin-5、Occluding的表達。結果：與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分、腦梗死面積百分比、腦組織中伊文思藍含量和腦缺血半暗帶區MMP-9、MMP-2蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01），腦缺血半暗帶區Claudin-5、Occluding蛋白表達水平顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，除TFC低劑量組大鼠腦缺血半暗帶區MMP-2蛋白表達水平降低不顯著外，其余各組大鼠上述指標均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。結論：TFC對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有一定的預防作用，可改善神經功能缺損，減少腦梗死面積；其機制可能與抑制MMP-9、MMP-2蛋白表達，促進Claudin-5、Occluding蛋白表達，降低血腦屏障的通透性有關。

關鍵詞 錦雞兒總黃酮；局灶性腦缺血再灌注損傷；血腦屏障；血腦屏障緊密連接相關蛋白；預防作用；大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of the pretreatment of total flavonoids of Caragana sinica （TFC） on the permeability of blood-brain barrier in focal cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， and to provide reference for further development and clinical treatment of cerebral ischemia stroke. METHODS： A total of 120 rats were randomly divided into sham operation group， model group， nimodipine group （positive control， 12.6 mg/kg） and TFC high-dose， medium-dose and low-dose groups （60， 30， 15 mg/kg）， with 20 rats in each group. Administration groups were given relevant medicine intragastrically. Sham operation group and model group were given constant volume of normal saline intragastrically， once a day， for consecutive 7 d. 2 h after last intragastric administration， focal cerebral ischemia-reperfusion injury model was established by suture-occluded method in those groups except for sham operation group. 24 h after reperfusion， neurological deficit score was performed； 2，3，5-TTC staining was used to calculate the percent age of cerebral infraction area； the content of Evans blue was measured by spectrophotometer so as to investigate the permeability of blood-brain barrier. The expression of matrix metalloproteinases 9 （MMP-9）， MMP-2 and blood-brain barrier closely linked protein （Claudin-5 and Occluding） in penumbra area of cerebral ischemic area were detected by Western blot. RESULTS： Compared with sham operation group， neurological deficit score， the percentage of cerebral infraction area， the content of Evans blue in cerebral tissue， the protein expressions of MMP-9 and MMP-2 in penumbra area of cerebral ischemic area were increased significantly （P<0.01）； the protein expressions of Claudin-5 and Occluding in penumbra area of cerebral ischemic area were decreased significantly （P<0.01）. Compared with model group， above indexes of rats in each medicine group were all improved significantly except that the decrease of protein expression of MMP-2 in penumbra area of cerebral ischemic area was not significant in TFC low-dose group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： TFC can prevent focal cerebral ischemia-reperfusion injury of rats， improve neurological deficit and reduce cerebral ischemia area and the permeability of blood-brain barrier. The mechanism of it may be associated with inhibiting the expressions of MMP-9 and MMP-2， promoting the protein expressions of Claudin-5 and Occluding.

KEYWORDS Total flavonoids of Caragana sinica； Focal cerebral ischemia-reperfusion injury； Blood-brain barrier； Blood-brain barrier closely linked protein； Preventive effect； Rats

缺血性腦卒中是一種常見病、多發病，其發病率、致殘率和致死率均很高[1]。目前，公認的唯一有效的治療方法是急性期溶栓治療，但溶栓后局部腦血流再通誘發再灌注損傷后導致的腦水腫是其常見的病理變化過程。然而，血腦屏障（Blood brain barrier，BBB）的破壞可導致血管源性腦水腫，是腦缺血再灌注損傷后腦水腫發生的重要病理基礎[2-3]。BBB緊密連接相關蛋白（Claudin-5和Occluding）是BBB的重要結構成分，其水平的高低與BBB的開放和關閉密切相關[4-5]。也有研究顯示，腦缺血再灌注后基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinases，MMP）表達增多，其中MMP-9和MMP-2被認為是BBB損傷的標志物之一[6]。近年來，有研究報道中藥黃酮類成分對BBB具有保護作用[7]，挖掘中藥黃酮類成分治療腦卒中具有較好的開發前景。

錦雞兒根又名金雀花根、板參、陽雀花根、土黃芪，是一種民間常用藥，具有活血祛風、補氣益腎之功，民間常用于治療腦缺血疾病，其主要藥效成分是錦雞兒總黃酮（Total flavonoids in Caragana sinica，TFC）[8]。已有研究發現，TFC對腦缺血再灌注損傷有保護作用，可提高腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦組織超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低丙二醛（MDA）含量，抑制血液黏度升高，降低血小板聚集，改善紅細胞變形能力[9-10]。本課題組前期研究證實，錦雞兒根提取物具有顯著抗缺血缺氧和抗疲勞能力[11-12]，對腦微血管內皮細胞有保護作用[13]。但TFC對腦缺血再灌注損傷后BBB的破壞是否具有保護作用，目前未見文獻報道。為此，本研究采用大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，探討TFC對模型大鼠BBB通透性的影響及作用機制，為進一步開發和臨床運用TFC治療缺血性腦卒中提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

moorVMS-LDF激光多普勒血流儀（英國Moor instruments公司）；Gemini XPS熒光酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；GelDoc 2000凝膠成像系統、Trans- Blot?轉膜儀和垂直電泳槽（美國Bio-Rad公司）。

1.2 藥品與試劑

TFC（由貴陽中醫學院實驗中心提取，批號：20160902，純度：采用紫外分光光度法測定，以蘆丁計含量為70.3%）；尼莫地平片（拜耳醫藥保健有限公司，批號：20160823，規格：30 mg/片）；伊文思藍（Evansblue，EB）染料（上海恒遠生物科技有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，美國Sigma公司）；化學發光超敏反應（ECL）試劑盒（美國Pierce公司，批號：36085）；兔抗鼠MMP-9、MMP-2 抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；兔抗鼠β-肌動蛋白（β-actin）、兔抗Claudin-5、Occluding單克隆抗體（美國Santa Cruz 公司）；羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）-辣根過氧化物酶（HRP）抗體（北京索萊寶科技有限公司）；其他試劑均為市售分析純。

1.3 動物

健康清潔級Wistar大鼠120只，♂，體質量（260±20） g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（京）2012-0001。購入后分籠飼養，自由飲水，飼養環境溫度為22～25 ℃、相對濕度為40%～60%。

2 方法

2.1 分組與給藥

將120只大鼠隨機分為6組：假手術組、模型組、尼莫地平組（陽性對照，12.6 mg/kg，根據臨床用量的10倍劑量換算而得）和TFC高、中、低劑量組（60、30、15 mg/kg，分別根據臨床用量的20、10、5倍劑量換算而得），每組20只。各給藥組大鼠每天灌胃給藥1次，連續給藥7 d；假手術組和模型組大鼠每天灌胃等量生理鹽水。

2.2 造模

末次給藥2h后，采用改良線栓法[14]制作局灶性腦缺血再灌注損傷模型。術前將大鼠禁食8 h，用面罩吸入持續給予2%三氟氯溴乙烷、70%N2+30%O2混合氣體將大鼠麻醉，固定在手術上，沿頸部中線切開皮膚及皮下組織，分離出右側的頸總動脈及其頸內和頸外動脈分枝，夾閉頸總動脈和頸外動脈，將線栓插入頸外動脈，經頸外動脈和頸內動脈分叉處進入頸內動脈至大腦中動脈，插入深度約（18.5±0.5） mm，用激光多普勒血流儀監測腦血流，以血流值下降至進線栓時也不再變化為止，并在整個阻塞過程中用動脈夾夾閉頸總動脈，使腦血流量保持在阻塞水平，造成局灶性腦缺血。缺血90 min后間斷式拔出線栓至頸外動脈切口處，直至線栓拔出之后用激光多普勒血流儀進行監測，當顯示腦血流緩慢恢復至接近基礎值時，再次縫合皮膚，消毒。假手術組大鼠除不栓線外其余操作均同模型組。手術過程中和術后大鼠均置于電熱恒溫板[（37±0.5） ℃]上保溫，密切觀察生命體征，待大鼠麻醉清醒后放入飼養籠中，20～25 ℃恒溫條件下飼養，自由進食進水。

2.3 神經功能缺損評分

觀察大鼠缺血再灌注24 h后的行為表現，參照文獻方法[15]對神經功能缺損進行評分：0分，無神經功能缺損癥狀；1分，輕微神經功能缺損，不能完全伸展左側前爪；2分，中度局灶性神經功能缺損，向左側轉圈；3分，重度局灶性神經功能缺損，向左側傾倒；4分，意識喪失，不能行走。

2.4 腦梗死面積測定

缺血再灌注24 h后，各組隨機選取6只大鼠麻醉，迅速斷頭取出完整腦組織放入腦槽中（-80 ℃）速凍3 min，從額極至枕極連續切取厚度為2 mm的冠狀腦片，浸于2%TTC 溶液中，避光，37 ℃恒溫孵育30 min。梗死區域腦組織呈白色，而周圍正常腦組織呈紅色。然后用4%的中性甲醛固定，數碼相機拍攝圖像后，運用圖像分析軟件（Image ProPlus 6.0）分別測出每片腦組織的梗死面積，最后計算出腦梗死面積百分比[腦梗死面積百分比（%）=腦梗死面積/總面積×100%]。

2.5 BBB通透性檢測

缺血再灌注24 h后，各組取6只大鼠，從尾靜脈注射2%EB溶液（4 mL/kg），麻醉后打開胸腔暴露心臟，剪開右心耳，經左心室灌注生理鹽水清除血管內血液和EB至右心耳流出液體清亮為止，斷頭取腦，稱取適量腦組織放入甲酰胺溶液中充分破碎（每100 mg 腦組織加入1 mL甲酰胺），然后將組織勻漿液置于60 ℃恒溫水浴中孵育24 h，取出一份勻漿液于4 ℃條件下以12 000×g離心10 min，取上清液200 μL加入96孔酶標板中，在酶標儀上測定630 nm波長處的吸光度（A）值。腦組織中EB含量（μg/g）=待測樣品中EB含量（μg/mL）×甲酰胺量（mL）/腦組織濕質量（g），待側樣品中EB含量根據前期已制備的標準曲線計算出。

2.6 腦缺血半暗帶區MMP-9、MMP-2、Claudin-5和Occluding蛋白表達檢測

采用Western blot法。腦缺血再灌注24 h后，各組取8只大鼠麻醉，取缺血區腦組織，稱量100 mg，放于無菌的EP管中，用Western blot及IP細胞裂解液浸泡，勻漿，然后在4 ℃條件下以12 000×g離心10 min，取上清液，用蛋白濃度測定試劑盒進行蛋白定量后調整樣品濃度。取50 μg蛋白樣品上樣，進行電泳（濃縮膠恒壓80 V，約40 min；分離膠恒壓120 V，電泳至溴酚藍到凝膠底部）、轉膜（恒流300 mA，冰浴轉膜2 h）、封閉（TBST溶解的5%脫脂奶粉，pH 7.5），室溫輕搖90 min，加入相應抗體MMP-9（1 ∶ 1 000）、MMP-2（1 ∶ 1 000）、Claudin-5 （1 ∶ 500）、Occluding（1 ∶ 1 000）及內參β-actin（1 ∶ 1 000），然后4 ℃孵育過夜。洗膜后用封閉液將羊抗兔IgG-HRP二抗稀釋（1 ∶ 5 000），然后37 ℃恒溫孵育90 min，加顯影和定影試劑，X射線膠片顯像，掃描。應用Image J分析軟件分析目的條帶和內參條帶的灰度值，以目的條帶與內參條帶的灰度值比值對MMP-9、MMP-2、Claudin-5和Occluding蛋白表達進行半定量分析。

2.7 統計學方法

采用SPSS 22.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠神經功能缺損評分和腦梗死面積百分比測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠神經功能缺損評分以及腦梗死面積百分比均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠的神經功能缺損評分和腦梗死面積百分比均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且具有一定的TFC量效關系。各組大鼠神經功能缺損評分和腦梗死面積百分比測定結果見表1。

3.2 BBB通透性測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中EB含量顯著升高（P<0.05或P<0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠腦組織中EB含量均顯著降低（P<0.05或P<0.01），且具有一定的TFC量效關系。各組大鼠腦組織中EB含量測定結果見表2。

3.3 腦缺血半暗帶區MMP-9、MMP-2、Claudin-5和Occluding蛋白表達水平測定結果

與假手術組比較，模型組大鼠腦缺血半暗帶區MMP-9、MMP-2蛋白表達水平顯著升高，Claudin-5、Occluding蛋白表達水平顯著降低，差異均有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，除TFC低劑量組大鼠腦缺血半暗帶區MMP-2蛋白表達水平降低不顯著外，其余各組大鼠上述指標均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。各組大鼠腦缺血半暗帶區MMP-9、MMP-2、Claudin-5和Occluding蛋白表達的電泳圖見圖1，測定結果見表3。

4 討論

BBB是腦毛細血管壁與神經膠質細胞形成的血漿與腦細胞之間的屏障和由脈絡叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，這些屏障能夠阻止大分子物質由血液進入腦組織，對腦組織內環境的穩定起重要作用[16]。因此，BBB完整性的破壞導致其通透性改變是腦缺血再灌注損傷的重要病理基礎。

腦缺血再灌注損傷導致BBB破壞的病理機制復雜，MMP是分解細胞外基質的蛋白水解酶類中最重要的一類，參與體內眾多的生物學反應，包括動脈粥樣硬化、炎癥、腫瘤生長及轉移等，其中MMP-2和MMP-9是MMPs家族的主要成員。有研究發現，MMP-2、MMP-9在急性大腦中動脈閉塞患者中的表達水平高低與腦梗死面積百分比大小具有顯著相關性[17]；大鼠大腦中動脈閉塞12 h后MMP-9水平顯著升高，腦梗死面積百分比和神經功能缺損評分均越高[18]。另有報道指出，腦出血24 h后MMP-9、MMP-2水平顯著升高，腦組織中含水量顯著增加，當給予MMP-9抑制劑后腦組織中含水量顯著減少[19]，可見MMP-2、MMP-9 所致的BBB破壞在缺血性腦卒中的病理變化中起著關鍵作用。MMP-2和MMP-9通過分解細胞外基質Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白導致BBB構成成分的變化，如BBB的重要構成成分緊密連接相關蛋白（Claudin-5和Occluding）的表達及其位置分布的異常均可破壞緊密連接的完整性，從而引起BBB通透性的改變[20]。Claudin-5、Occluding蛋白表達發生變化時，BBB的功能可能隨之改變，Claudin-5、Occluding蛋白表達水平下降的程度可作為BBB損傷程度的標志[21]。尼莫地平是一種經典的Ca2+通道阻滯藥，可抑制平滑肌收縮，有效緩解腦血管痙攣，擴張腦血管，增加腦血流量，改善BBB通透性，故本研究以其為陽性對照藥。本研究結果顯示，TFC預處理可降低大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能缺損評分和腦梗死面積百分比，可抑制腦缺血再灌注后MMP-2、MMP-9蛋白的表達和促進Claudin-5和Occluding 蛋白的表達。

綜上所述，TFC對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷具有一定的預防作用，可降低BBB的通透性。其作用機制可能與抑制MMP-2、MMP-9蛋白的表達，促進Claudin-5和Occluding蛋白的表達有關，這為進一步闡明錦雞兒在缺血性腦卒中具有神經保護作用提供了一定的實驗基礎。

參考文獻

[ 1 ] DING J，ZHOU D，SUI M，et al. The effect of normobaric oxygen in patients with acute stroke：a systematic review and meta-analysis[J]. Neurol Res，2018.DOI：10.1080/01616412.2018.1454091.

[ 2 ] ZHENG YP，WANG FX，ZHAO DQ，et al. Predictive power of abnormal electroencephalogram for post-cerebral infarction depression[J]. Neural Regen Res，2018，13（2）：304-308.

[ 3 ] HALEY MJ，LAWRENCE CB. The blood-brain barrier after stroke：structural studies and the role of transcytotic vesicles[J]. J Cereb Blood Flow Metab，2017，37（2）：456-470.

[ 4 ] YANG Y，KIMURA-OHBA S，THOMPSON JF，et al. Vascular tight junction disruption and angiogenesis in spontaneously hypertensive rat with neuroinflammatory white matter injury[J]. Neurobiol Dis，2018.DOI：10.1016/j.nbd.

[ 5 ] SUN J，YU L，HUANG S，et al. Vascular expression of angiopoietin1，α5β1 integrin and tight junction proteins is tightly regulated during vascular remodeling in the post- ischemic brain[J]. Neuroscience，2017，24（362）：248-256.

[ 6 ] ZHANG S，AN Q，WANG T，et al. Autophagy- and MMP- 2/9-mediated reduction and redistribution of ZO-1 contribute to hyperglycemia-increased blood-brain barrier permeability during early reperfusion in stroke[J]. Neuroscience，2018.DOI：10.1016/j.neuroscience.2018.02.035.

[ 7 ] 陳峰，袁媛，李澤友，等.黃酮類化合物組織分布研究進展[J].中國藥房，2007，18（30）：2379-2382.

[ 8 ] 國家中醫藥管理局中華本草編委會.中華本草[M].上海：上海科學技術出版社，1999：392.

[ 9 ] 李媛媛，石任兵，岳永花，等.小葉錦雞兒總黃酮對腦缺血再灌注損傷大鼠的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（24）：273-277.

[10] 康亞男，李媛媛，岳永花.小葉錦雞兒總黃酮提取工藝研究及對腦缺血再灌注損傷大鼠的作用[J].藥物評價研究，2013，36（1）：22-25.

[11] 何前松，何峰，蒲翔，等.陽雀花根提取物對小鼠抗缺血缺氧能力的影響[J].貴州農業科學，2012，40（2）：115-116.

[12] 何前松，何峰，馮泳.陽雀花根提取物對小鼠抗運動疲勞能力的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（2）：177-180.

[13] HE QS，ZHANG L，FAN ZY，et al. Protective effects of total flavonoids in Caragana against hypoxia/reoxygenation-induced injury in human brain microvascular endothelial cells[J]. Biomed Pharmacother，2017.DOI：10.1016/ j.biopha.

[14] HE Q，WANG S，LIU X，et al. Salvianolate lyophilized injection promotes post-stroke functional recovery via the activation of VEGF and BDNF -TrkB-CREB signaling pathway in T1DM-MCAO rats[J]. Int J Clin Exp Med，2015，8（1）：108-122.

[15] FENG SQ，AA N，GENG JL，et al. Pharmacokinetic and metabolomic analyses of the neuroprotective effects of salvianolic acid A in a rat ischemic stroke model[J]. Acta Pharmacol Sin，2017，38（11）：1435-1444.

[16] BEHROUZIFAR S，VAKILI A，BANDEGI AR，et al. Neuroprotective nature of adipokine resistin in the early stages of focal cerebral ischemia in a stroke mouse model[J]. Neurochem Int，2018.DOI：10.1016/j.neuint.

[17] YANG Y，ROSENBERG GA. Matrix metalloproteinases as therapeutic targets for stroke[J]. Brain Res，2015，14（162）：30-38.

[18] ZHANG Y，ZHANG P，SHEN X，et al. Early exercise protects the blood-brain barrier from ischemic brain injury via the regulation of MMP-9 and occludin in rats[J]. Int J Mol Sci，2013，14（6）：11096-11112.

[19] REUTER B，RODEMER C，GRUDZENSKI S，et al.Effect of simvastatin on MMPs and TIMPs in human brain endothelial cells and experimental stroke[J]. Transl Stroke Res，2015，6（2）：156-159.

[20] ZHANG YM，XU H，SUN H，et al. Electroacupuncture treatment improves neurological function associated with regulation of tight junction proteins in rats with cerebral ischemia reperfusion injury[J]. Evid Based Complement Alternat Med，2015.DOI：10.1155/2015/898474.

[21] YANG F，ZHOU L，WANG D，et al. Minocycline ameliorates hypoxia-induced blood-brain barrier damage by inhibition of HIF-1α through SIRT-3/PHD-2 degradation pathway[J]. Neuroscience，2015，24（304）：250-259.

（收稿日期：2018-03-05 修回日期：2018-05-09）

（編輯：林 靜）