丙氨酰—谷氨酰胺二肽合成工藝研究進展

石昌榮 唐果 莊榮強 趙玉芬

摘 要 目的：為丙氨酰-谷氨酰胺二肽（Ala-Gln）類藥物的進一步研究和生產提供參考。方法：以“丙氨酰-谷氨酰胺二肽”“合成工藝”“谷氨酸水解法”“D-氯（溴）代丙酸法”“N-羧基內酸酐法”“活化酯法”“三苯基膦/六氯乙烷縮合法”“Ala-Gln peptides drugs”“Synthetic process”“Appel condensation method”等為關鍵詞，組合查詢在中國知網、Web of Science等數據庫中收錄的1987年1月-2017年12月發表的相關研究文獻，進行歸納和總結。結果與結論：共檢索到相關研究文獻 678篇，其中有效文獻25篇。Ala-Gln以往的合成方法主要有谷氨酸水解法、D-氯（溴）代丙酸法、N-羧基內酸酐法、活化酯法、酶催化合成法等，這些方法存在步驟煩瑣、反應成本高、帶有毒性、合成路線長、大批量生產的產率難以控制等缺點，嚴重制約了其推廣應用。三苯基膦/六氯乙烷縮合法具有合成成本低、可行性好、穩定性高、合成周期短等突出優點，為推動Ala-Gln類藥物大規模的生產和應用提供了可能。

關鍵詞 丙氨酰-谷氨酰胺二肽；合成工藝；三苯基膦/六氯乙烷縮合法

中圖分類號 R914 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）14-1999-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.14.28

谷氨酰胺（Glutamine，Gln）是人體的非必需氨基酸，是合成核酸和谷胱甘肽等的前體物質，其生理功能具有多樣性。研究發現，Gln在保護肝臟功能、治療胃腸疾病、改善患者營養狀況等方面起著重要的作用[1-3]。其主要機制為：（1）Gln作為氧化應激的調節劑，可逆轉脂質過氧化過程，恢復谷胱甘肽含量，通過過氧化氫誘導的谷胱甘肽過氧化物酶以增強超氧化物歧化酶和谷胱甘肽還原酶的活性，增加細胞膜的穩定性，從而對抗氧自由基對肝臟的氧化損傷[4-5]；（2）手術、創傷、嚴重感染等應激狀態下會導致患者營養不良，提高Gln在血液中的濃度，可促進蛋白質的合成、降低其分解，改善患者營養狀況[6]。大量研究表明，在人類腫瘤（如三陰性乳腺癌、肺癌、前列腺癌、神經膠質瘤、淋巴瘤等）中，Gln的代謝途徑處于異常激活狀態，其機體需要量大大超過了機體自身合成Gln的能力[7-8]。Lieberman BP等[9]利用18F-（2S，4R）-4-氟代谷氨酰胺探針對腫瘤內Gln分解途徑進行監測，實現了活體層面的腫瘤正電子發射斷層掃描（PET）成像，發現Gln作為代謝的關鍵營養因子具有用作示蹤代謝指示劑的可能，為Gln的研究開辟了新的思路。另有研究發現，Gln可以調控巨噬細胞炎癥反應通路，而巨噬細胞在腫瘤的發展和免疫抑制等方面起著重要的作用，也預示著Gln在介導腫瘤的免疫治療中有著巨大的潛力[10]。然而有關Gln理化性質的研究發現，其水溶性小（溶解度只有36 g/L），以水溶液形式長期儲存時化學穩定性不足，且高溫消毒時易生成有毒的焦谷氨酸和氨等[11]，這些缺點限制了Gln在臨床上的使用。因此，合成既不改變Gln原有功能、又能克服單體Gln已知缺點的Gln類似物成為推動Gln應用的關鍵。有研究通過合成的丙氨酰-谷氨酰胺二肽 （Ala-Gln） 作為 Gln的替代品，以彌補Gln的不足：Ala-Gln具有高熱穩定性，水溶性達到586 g/L，其在體內可以快速地被代謝成Ala和Gln，具有很好的生物利用度，口服后僅有1%～2%的二肽從尿液中被排出體外，因此其在臨床上被廣泛用作Gln的替代品[11]。周燕萍等[12]在對64例臨床病例的研究中發現，在胃腸道術后應用Ala-Gln是安全和有效的。目前，文獻中報道的Ala-Gln合成方法主要有酸酐法、酰鹵法和活化酯法[13-14]。為利于該類藥物的后續研究和生產，筆者以“丙氨酰-谷氨酰胺二肽”“合成工藝”“谷氨酸水解法”“D-氯（溴）代丙酸法”“N-羧基內酸酐法”“活化酯法”“三苯基膦/六氯乙烷縮合法”“Ala-Gln peptides drugs”“Synthetic process”“Appel condensation method”等為關鍵詞，組合查詢在中國知網、Web of Science等數據庫中收錄的1987年1月-2017年12月發表的相關研究文獻（共檢索到相關研究文獻 678篇，其中有效文獻25篇），進行了歸納和總結。

1 Ala-Gln合成方法

1.1 谷氨酸水解法

由于谷氨酸比較穩定，Yasutsugu S等[15]利用芐氧羰基保護的Ala（Cbz-Ala）和谷氨酸甲酯通過二環己基碳二亞胺（DCC）縮合反應合成二肽，可用催化氫解脫去氨基的Cbz保護基，得到丙氨酸谷氨酸γ-羧基甲酯，該甲酯經濃氨水氨解后，即可得到Ala-Gln（見圖1）。

該方法采用了價格便宜的谷氨酸替代Gln，實現了Ala-Gln的合成，但反應過程中需要對氨基酸進行保護和脫保護，步驟較為煩瑣，同時也增加了反應成本。另外，貴金屬鈀的高成本和殘留以及反應生成難除盡的二環己基脲（DCU）帶來的毒性制約了該方法的應用，故不適于規模化生產。

1.2 D-氯（溴）代丙酸法

Yasutsugu S等[15]利用手性的D-氯（溴）代丙酸經二氯亞砜活化，形成酰氯，然后滴加到Gln的氫氧化鈉水溶液中，保持pH在10左右，反應中間體經氨解后生成Ala-Gln（見圖2）。

該合成方法操作較簡便、步驟短，但手性原料貴，大大增加了合成成本。該合成過程使用到水作為溶劑，而反應物酰氯又容易水解，因此該方法會產生較多的副產物從而導致偶聯產率較低。此外，D-2-溴丙酰基-L-Gln的氨解需要升高溫度，亦導致副產物的增加，尤其是導致氨基酸的消旋化，最終得到的Ala-Gln的光學純度較低，比如產物中可能混有D-Ala-L-Gln、D-Ala-D-Gln、L-Ala-D-Gln等消旋體。產率低問題成為限制該合成工藝發展的主要因素。肖湘等[16]報道，將 2-（氯代）丙酰基氯與Gln反應，然后再氨解，通過兩步反應能簡便而有效地獲得Ala-Gln，且保持溶液在堿性條件（pH為9～10.5）時，產品收率可達到 52%，但其純化水平距離大規模生產要求還有很長一段路。

1.3 N-羧基內酸酐法

丙氨酸與光氣反應生成N-羧基內酸酐，隨后將N-羧基內酸酐緩慢滴加到Gln的水溶液中，通過添加氫氧化鈉使溶液的pH保持在10.2，反應完成后酸化，即可得到Ala-Gln[17]（見圖3）。

該方法合成步驟短，避免了使用保護基，合成成本較低。但該方法缺點也非常明顯：一方面由于N-羧基內酸酐活性非常高，無法保存；另一方面，N-羧基內酸酐與Gln反應時，容易生成三肽、四肽等副產物，其副產物的總量很大，導致該方法的產率較低，且對目標產物的純化較為困難。同時，光氣為有毒物質，當反應不完全時可能對人體產生毒性。陳然等[18]報道用鄰苯二甲酰基作為保護基，采用混合酸酐法將鄰苯二甲酰基保護的丙氨酸與 L-Gln縮合成鄰苯二甲酰基保護的Ala-L-Gln，最后采用水合肼脫除鄰苯二甲酰基，并按中試規模制備了目標產物L-Ala-L-Gln，以L-Ala計總摩爾收率為34.4%。較高的收率在一定程度上推動了該方法用于大規模生產的進程。但由于水合肼腐蝕性強，在大規模生產過程中需要特殊設備，也增加了生產成本，且目前產物的收率和雜質不穩定等缺點也限制了其工業化應用。

1.4 活化酯法

潘和平等[19]利用叔丁氧羰基保護的丙氨酸，與N-羥基琥珀酰亞胺在DCC縮合下，形成穩定的活化酯，再將活化酯滴加到谷氨酸甲酯飽和的碳酸氫鈉溶液中，反應完成后酸化，得到叔丁氧羰基保護的丙氨酰-谷氨酸甲酯二肽，產物經不飽和脂肪酸脫去叔丁氧羰基保護基，再經濃氨水氨解后，即可得到Ala-Gln（見圖4）。

該合成方法操作較簡便，且隨著其工藝的成熟，合成過程中的雜質也更易于控制，因此是目前各廠家合成Ala-Gln的主要工藝。但其不足之處是合成路線長，導致最后一步無法獲得較多的合格產品，且其副產物DCU很難完全除去，加之原料N-羥基琥珀酰亞胺價格貴，也限制了其進一步大規模推廣應用。

1.5 三苯基膦/六氯乙烷（Appel）縮合法

本課題組采用亞磷酸酯保護的丙氨酸與三苯基膦和六氯乙烷先在有機溶劑中反應生成活化酯，再與Gln于有機溶劑中進行反應，而后在酸溶液中脫去N端保護基團，最終得到Ala-Gln（見圖5）。

該合成方法具有操作較簡便、用時短、產率高、合成成本低等優點，適宜大規模生產，獲得了中國專利：CN1683391[20]，國際專利公開號：WO03/106481A1。該方法優化了Ala-Gln合成反應條件，通過了中試，驗證了小試工藝技術的可行性、穩定性，為Ala-Gln合成的國產化推廣奠定了基礎。本課題組利用中試產品已申報3類原料藥，并獲受理（閩新藥受理號：20030021）。

1.6 酶催化合成法

Tabata K等[21]報道了通過大腸桿菌來生產Ala-Gln的發酵工藝，該大腸桿菌上表達有L-氨基酸α-連接酶，可三磷酸腺苷依賴性地合并Ala和Gln，從而催化Ala-Gln的形成。Yokozeki K等[22]篩選了能夠催化Ala-Gln合成反應的971種微生物菌株，發現短穩桿菌（ATCC 14234）具有非常好的效能，并從該菌中純化出了可用于生產Ala-Gln的酶。Miyazawa T等[23]報道了一種動力學控制酶催化合成Ala-Gln的前體Z-Ala-Gln的方法：利用低廉的木瓜蛋白酶作為催化劑，可以在35 ℃、pH 9.5的條件下合成Z-Ala-Gln，Ala-Gln的產率可以達到35.5%。Hernández JG等[24]利用機械研磨的方法，使酶催化生產Ala-Gln的產率提高至45%。洪翔等[25]利用重組枯草芽孢桿菌L-氨基酸連接酶成功地生物合成出Ala-Gln，為Ala-Gln的生物制造奠定了理論基礎。利用酶催化的方法反應不需要使用保護基，沒有用到化學試劑，可以得到手性單一的產物，小批量生產的產率較高；但同時亦有發酵產酶純化過程復雜、酶在使用一段時間后容易失活、大批量生產的產率較難控制等不足。

2 結語

綜上所述，多種合成Ala-Gln的方法和工藝推動了其在臨床進一步推廣應用。目前的合成方法主要存在氨解時氨基酸存在手性異構等問題，這些問題都限制了其工業化應用并給產品的安全性帶來了隱患。與其他方法相比，谷氨酸水解法煩瑣的反應步驟、高額的合成成本以及毒性問題使其具有一定的局限性。D-氯（溴）代丙酸法相比谷氨酸水解法在合成步驟上更為簡易，成本相對低廉，但其產物的純度是限制其發展的主要因素。N-羥基丙酸酐法較之前兩種方法，合成步驟更為簡易，合成周期短，因避免了使用保護基使其合成成本更加低廉，但該方法存在反應副產物過多導致其目標產物產率不夠高的問題，使其用于大規模生產受到限制。目前活化酯法是應用最廣泛的合成方法，較之以上方法其具有較高的產率、較短的合成周期等優點，但高成本是限制其大規模生產的主要原因。Appel縮合法的出現以其合成成本更加低廉、可行性好、穩定性高、合成周期短等突出的優點為推動Ala-Gln的大規模生產和應用提供了可能。相對于化學合成的方法，酶催化合成法可以得到手性單一的產物，小批量產率較高、毒性小，但其生產條件要求極為嚴格，生產中的酶極易失活。

參考文獻

[ 1 ] 周健，司繼剛. 丙氨酰谷氨酰胺的臨床應用進展[J].中國藥房，2016，27（26）： 3739-3741.

[ 2 ] HARTMANN R，LICKS F，SCHEMITT E G，et al. Effect of glutamine on liver injuries induced by intestinal ischemia-reperfusion in rats[J]. Nutri Hosp，2017，34（3）：548-554.

[ 3 ] NEWSHOLME EA，CALDER PC.The proposed role of glutamine in some cells of the immune system and speculative consequences for the whole animal[J]. Nutrition，1997，13（13）：728-730.

[ 4 ] ZHAI Y，SUN Z，ZHANG J，et al. Activation of the TOR signalling pathway by glutamine regulates insect fecundity[J]. Sci Rep，2015. DOI：10.1038/SREP/0694.

[ 5 ] AMORES-S NCHEZ MI，MEDINA MA. Glutamine，as a precursor of glutathione，and oxidative stress[J]. Mol Genet Metab，1999，67（2）：100-108.

[ 6 ] COSTER J，MCCAULEY R，HALL J. Glutamine： metabolism and application in nutrition support[J]. Asia Pac J Clin Nutr，2004，13（1）： 25-31.

[ 7 ] TIAN Y，DU W，CAO S，et al. Systematic analyses of glutamine and glutamate metabolisms across different cancer types[J]. Chin J Cancer，2017，36（1）：88-96.

[ 8 ] ZHANG J，PAVLOVA N N，THOMPSON C B. Cancer cell metabolism： the essential role of the nonessential amino acid，glutamine[J]. EMBO J，2017，36（10）：1302-1315.

[ 9 ] LIEBERMAN BP，PLOESSL K，WANG L，et al. PET imaging of glutaminolysis in tumors by 18F-（2S，4R）4-fluoroglutamine[J]. J Nucl Med，2011，52（12）：1947-1955.

[10] SARTORI T，GALVAO DOS SANTOS G，NOGUEIRA- PEDRO A，et al. Effects of glutamine，taurine and their association on inflammatory pathway markers in macrophages[J]. Inflammopharmacology，2018，26（3）：829-838.

[11] YAGASAKI M，HASHIMOTO S. Synthesis and application of dipeptides：current status and perspectives[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2008，81（1）：13-22.

[12] 周燕萍，龔茜芬，王自強. 丙氨酰谷氨酰胺雙肽在胃腸道術后應用的安全性和有效性觀察[J].中國藥房，2005，16（17）：1321-1323.

[13] 楊琪. 丙氨酰谷氨酰胺的制備工藝改進[J]. 科技展望，2015（8）：77.

[14] 柯遠. 丙谷二肽合成工藝改進[D]. 濟南：濟南大學，2013.

[15] YASUTSUGU S，SHUMPEI S，SHIRO A. Studies on the synthesis of peptides containing glutamine as the c-terminal.1.protection of amide-nitrogen with xanthyl group during peptide synthesis[J]. Bull Chem Soc Jpn，2006，35（12）： 1966-1970.

[16] 肖湘，覃軍，王祥智. 丙氨酰-谷氨酰胺的簡便有效合成 [J]. 化學研究與應用，2002（3）：332-333.

[17] DJA ERICKSON RA，FROEN DE，et al. The synthesis of the high-potency sweetener，nc-00637. part 2： preparation of the pyridine moiety[J]. Org Process Res Dev，2004，8（1）： 62-71.

[18] 陳然，錢紹松，吳曉燕，等. 10 t/a中試規模制備二肽L-丙氨酰-L-谷氨酰胺[J]. 精細化工，2005（12）：958-960.

[19] 潘和平，王良友，徐琪壽，等. 液相合成含谷氨酰胺、天門冬酰胺肽鏈的方法及其中間體：中國，CN1295079[P].2001-05-16.

[20] 唐果，趙玉芬，許鵬翔，等. N（2）-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽合成方法：中國，CN1683391[P].2005-10-19.

[21] TABATA K，HASHIMOTO S. Fermentative production of L-alanyl-L-glutamine by a metabolically engineered Escherichia coli strain expressing L-amino acid alpha-ligase [J]. Appl Environ Microbiol，2007，73（20）： 6378-6385.

[22] YOKOZEKI K，HARA S. A novel and efficient enzymatic method for the production of peptides from unprotected starting materials[J]. J Biotechnol，2005，115（2）：211- 220.

[23] MIYAZAWA T，HORIMOTO T，TANAKA K. Kinetically controlled peptide synthesis mediated by papain using the carbamoylmethyl ester as an acyl donor[J]. Int J Pept Res Ther，2014，20（3）：371-376.

[24] HERN?NDEZ JG，ARDILA-FIERRO KJ，CRAWFORD D，et al. Mechanoenzymatic peptide and amide bond formation [J]. Green Chem，2017，19（11）： 2620-2625.

[25] 洪翔，朱新雅，賈子樊，等.利用重組枯草芽孢桿菌L-氨基酸連接酶合成丙谷二肽 [J]. 發酵科技通訊，2017，46（2）： 83-87.

（收稿日期：2018-02-06 修回日期：2018-04-08）

（編輯：張 靜）