淫羊藿次苷Ⅱ通過調節MMP-2、MMP-9和TIMP-1的表達抗自發性高血壓大鼠心肌纖維化

付 舒，李葉麗，吳雨婷，岳 云，高 楊，楊丹莉

(基礎藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯合實驗室，遵義醫學院，貴州 遵義 563003)

心肌纖維化(myocardial fibrosis, MF) 主要表現為心臟間質成纖維細胞過度增殖以及細胞外基質(extracellular matrix, ECM)過度沉積，以膠原成分比例失調，且排列紊亂為主要特征的疾病。MF可導致心臟收縮和舒張功能障礙[1]。許多報道顯示，心臟纖維化是不同病理情況下心功能不全發生的重要原因[2-4]，最終導致心臟衰竭致心臟功能喪失[5]。研究表明，ECM合成或降解失衡是導致MF的重要環節，而基質金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)相互作用是調節ECM動態平衡的關鍵[6]。淫羊藿次苷Ⅱ(icarisid Ⅱ，ICS Ⅱ)是從中藥淫羊藿中提取的一種多羥基黃酮類單體，是淫羊藿中的主要成分之一，具有抗炎、抗骨質疏松、抗氧化、改善心肌細胞凋亡等多種生物學和藥理學作用[7-8]。本研究旨在觀察Ics Ⅱ是否具有抗自發性大鼠MF的作用，以及該效應是否與其影響MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達有關。

1 材料與方法

1.1實驗動物與分組以13周齡的♂自發性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rat, SHR)大鼠20只作為研究對象，以同齡♂WKY大鼠5只為陰性對照組，體質量280～320 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK(京)2012-0001，SPF級。將SHR大鼠隨機分為ICS Ⅱ低劑量組(4 mg·kg-1, ICS Ⅱ-L)、中劑量組(8 mg·kg-1, ICS Ⅱ-M)、高劑量組(16 mg·kg-1, ICS Ⅱ-H)和模型組(SHR組)。ICS Ⅱ-L、ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組持續灌胃12周，WKY組、SHR組分別給予等體積雙蒸水。ICS Ⅱ溶解于雙蒸水中，每次大鼠灌胃給藥前，超聲10 min，制成混懸液。

Tab 1 Sequences of primers used for real time polymerase chain reaction

1.2藥品、試劑與儀器ICS Ⅱ，純度≥98%，購于南京澤朗醫藥有限公司；Masson三色染色試劑盒購于北京索萊寶科技有限公司；GAPDH、MMP-2、MMP-9、TIMP-1引物購自生工生物工程有限公司；逆轉錄試劑盒購自TaKaRa生物工程公司；RNA熒光混合物購自美國Bio-Rad公司；MMP-2兔抗大鼠抗體購自生工生物工程有限公司；GAPDH、MMP-9、TIMP-1、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ兔抗大鼠抗體、山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG，均購自武漢三鷹生物技術有限公司；ECL發光劑購于七海生物有限公司。5417R離心機、RNA逆轉錄儀(德國Eppendorf公司)；Mini Trans-Blot轉移系統、Mini-PROTEAN3電泳儀、CCD成像系統、real time RT-PCR擴增儀(美國Bio-Rad公司)；光學顯微鏡及照相系統(日本 Olympus公司)。

1.3大鼠尾部血壓的測量采用Kent Scientific CODA鼠尾無創血壓計測量清醒、安靜狀態下大鼠尾部動脈收縮壓。

1.4大鼠左心質量指數的計算給藥至26周后，2%戊巴比妥(2 mg·kg-1)腹腔注射麻醉，取出各組大鼠心臟組織，分離左心室，計算左心質量指數。左心質量指數=左心重量(g) /大鼠體重(g)×100。

1.5大鼠心臟組織病理學檢查取大鼠左心室組織，浸入4%中性甲醛溶液中固定48 h后，石蠟包埋、切片，Masson染色，光學顯微鏡下觀察心肌膠原含量變化。

1.6RealtimePCR法檢測左心室組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA的表達水平參照Gen-Bank 基因庫中關于大鼠MMP-2、MMP-9、TIMP-1 mRNA序列設計引物，引物序列見Tab 1。取各組心臟組織100 mg，置于1 mL TRIzol中提取總RNA并純化。目的基因表達用相對定量法，以PCR擴增過程中熒光信號強度達到閾值所需要的循環數(cycle threshold，Ct值)為統計參數，Ct值的平均值=(Ctl+Ct2)/2(重復管)；dCt=Ct值的平均值-中間值(相同檢測基因的不同樣品Ct值的平均值中居中的值)；基因的轉錄水平=2-dCt；相對定量=目的基因的表達/內參基因的表達×100，將WKY組的mRNA表達設為100。

1.7Westernblot檢測左心室組織中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白的表達取大鼠心臟組織約200 mg，剪碎后，放入1 mL RIPA裂解液中，加入蛋白磷酸酶抑制劑10 μL及PMSF 10 μL，混勻，冰上勻漿后靜置，離心，取上清液，BCA法測定待測樣品的總蛋白濃度。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉至PVDF膜，TBST洗膜，5%蛋白封閉液室溫封閉2 h后，TBST洗膜。一抗GAPDH (1 ∶5 000)、MMP-2 (1 ∶500)、MMP-9 (1 ∶500)、TIMP-1 (1 ∶500)、Collagen Ⅰ (1 ∶1 000)、Collagen Ⅲ (1 ∶1 000) 4℃搖床孵育過夜；TBST洗膜，HRP標記山羊抗兔IgG (1 ∶5 000)、山羊抗小鼠IgG (1 ∶5 000)常溫搖床孵育1 h，洗膜后用ECL化學發光劑顯色，采用CCD成像系統獲取圖像。

2 結果

2.1ICSⅡ對SHR大鼠收縮壓的影響與WKY組相比，26周齡SHR組大鼠收縮壓明顯上升(P<0.05)，是WKY組的1.54倍；與SHR組相比，給予ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H后收縮壓分別下降了10.32%、15.30%(P<0.05)，見Fig 1。

2.2ICSⅡ對SHR大鼠左心質量指數的影響如Fig 2所示，與WKY組相比，SHR組大鼠左心質量指數明顯增加(P<0.05)；給予ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H可降低左心質量指數，且差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3大鼠左心室膠原纖維沉積情況Fig 3的Mas- son染色結果顯示，膠原纖維呈藍色，心肌細胞呈紅色。WKY組心肌肌束間有較少膠原沉積。與WKY組相比，SHR組心肌肌束間隙不同程度增大，心肌細胞間質可見明顯纖維化改變，伴有嚴重的膠原沉積。與SHR組相比，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組心肌細胞纖維化程度明顯減輕。說明ICS Ⅱ對SHR 心肌纖維化及其膠原沉積有一定的改善作用。

Fig 1 Effect of ICS Ⅱ on systolic

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

Fig 2 Effects of ICS Ⅱ on left ventricular

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

2.4ICSⅡ對SHR大鼠左心室CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表達的影響Fig 4的Western blot檢測結果發現，與WKY組相比，SHR組大鼠左心室中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組SHR大鼠左心室中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。

2.5ICSⅡ對SHR大鼠左心室MMP-2、MMP-9、TIMP-1mRNA表達的影響如Fig 5所示，與WKY組比較，模型組SHR大鼠左心室MMP-2、MMP-9 mRNA的表達水平均明顯增加(P<0.05)，TIMP-1 mRNA的表達水平明顯下降(P<0.05)；與SHR組比較，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組SHR大鼠左心室MMP-2、MMP-9 mRNA的表達明顯下降，TIMP-1 mRNA的表達明顯增加(P<0.05)。

Fig3LeftventricularcollagendepositioninSHRs(×400)

A: WKY; B: SHR; C: ICS Ⅱ-L; D: ICS Ⅱ-M; E: ICS Ⅱ-H.

Fig 4 Effect of ICS Ⅱ administration on protein expressionof Collagen Ⅰ,Collagen Ⅲ in left ventricle of

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

2.6ICSⅡ對SHR大鼠左心室MMP-2、MMP-9、TIMP-1蛋白表達的影響Fig 6的Western blot檢測結果發現，與WKY組相比，SHR組大鼠左心室中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)，TIMP-1的蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)；與SHR組相比，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組SHR大鼠左心室中MMP-2、MMP-9蛋白表達水平明顯下降，TIMP-1的蛋白表達水平明顯升高(P<0.05)。

Fig 5 Effects of ICS Ⅱ on mRNA expressionof MMP-2, MMP-9,TIMP-1in left ventricle of

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

Fig 6 Effect of ICS Ⅱ administrationon protein expression of MMP-2,MMP-9, TIMP-1 in left ventricle of

*P<0.05vsWKY;#P<0.05vsSHR

3 討論

SHR大鼠是一種與人類慢性高血壓接近的動物模型。有研究發現，SHR大鼠在20周齡時心肌纖維增多，心肌間質內可見大量膠原聚集，心肌膠原面積的比例明顯增高[9]。本研究中，14 周齡♂SHR大鼠喂養至26周齡，SHR組收縮壓、左心質量指數明顯升高，病理學Masson染色結果顯示，SHR組心肌肌束間隙不同程度增大，心肌細胞間質和血管周圍可見明顯纖維化改變，并伴有嚴重的膠原沉積，表明26周齡的SHR已發生明顯的MF，這與本課題組前期研究一致[10]。給予ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H后，SHR組收縮壓、左心質量指數下降，MF程度明顯改善。

Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維蛋白是心臟ECM的主要成分[11]，MMPs是降解ECM成分的主要酶系，在心血管系統的重構過程中，通過影響ECM的降解，在高血壓血管病變的發生、發展中起重要作用[12]。MMPs跟據作用底物的不同分為 5大類，而明膠酶MMP-2和MMP-9與心血管疾病密切相關[13-14]。在心肌組織中，MMP-2和MMP-9已經被證明是ECM的主要調節因子，它們對變性的纖維膠原蛋白具有底物親和力[15]。研究表明，心肌梗死后，MMPs特別是MMP-2上調，引起MMPs和TIMPs在心臟組織中的比例失衡，導致心臟ECM的降解，心肌組織厚度減小(心室壁變薄)，最終導致心功能的惡化[15-16]。本研究結果顯示，與WKY組相比，SHR組大鼠左心室MMP-9、MMP-2、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達明顯增加，TIMP-1的表達明顯降低，MMP-9/TIMP-1比值增大，導致 MMPs/TIMPs失衡，促進MF的發展；與SHR組相比，ICS Ⅱ-M、ICS Ⅱ-H組SHR大鼠左心室中MMP-9、MMP-2、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達明顯下調，TIMP-1的表達明顯上調，MMP-9/TIMP-1比值降低。表明給予ICS Ⅱ干預后，SHR心肌MMPs/TIMPs 的失調得到明顯改善，提示ICS Ⅱ 可能通過抑制MMP-9、MMP-2的表達，促進TIMP-1表達，改善MMPs/TIMPs 的失調，調控膠原的合成與降解，減輕SHR大鼠的MF。

綜上，ICS Ⅱ具有抗SHR大鼠MF的作用，其機制可能與降低血壓，上調MMP-9、MMP-2，下調TIMP-1的表達，改善MMPs/TIMPs的失調有關。