桑白皮多酚對B16細胞內黑色素生成的影響及其機制

吳永祥，畢淑峰，姜 薇，崔 譜，金有貞，金泰完

( 1. 黃山學院生命與環境科學學院, 安徽 黃山 245041; 2. 安東國立大學食品科學與生物技術學院，韓國 安東 760749 )

黑色素是由黑色素細胞合成的高分子生物色素，分布于皮膚真皮層中，決定了皮膚的顏色。適當的黑色素生成有利于皮膚健康，可有效吸收紫外線，從而保護皮膚免受光老化的損傷；而黑色素過度合成不僅簡單地使皮膚變黑，而且可直接或間接導致皮膚出現雀斑、白癜風等，甚至會引起皮膚癌，嚴重損害人體健康[1]。黑色素的生成含量主要受酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)的調節，TYR是黑色素起始反應的關鍵限速酶[2]。黑色素的生成速度和產量還受酪氨酸酶相關蛋白-1(tyrosinase-related protein-1, TRP-1)、TRP-2、小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia associated transcription factor , MITF)的調控[3]。研究發現[4-5]，中草藥及植物中化學成分可有效抑制黑色素的生成。

桑白皮(CortexMori)史載于《神農本草經》，而歷代本草均有收錄，為我國傳統常用中藥材之一。桑白皮為桑的干燥根皮，主產地有安徽亳州、浙江淳安、江蘇泰興、四川通江等地。桑白皮的化學成分較為復雜，主要含多酚類化合物、香豆素類化合物、芪類化合物、多糖等[6]。桑白皮多酚(polyphenol fromCortexMori，CMP)主要包括Diels-Alder型加合物和黃酮類化合物等，是桑白皮中一種非常重要的次生代謝產物，屬于桑屬植物的特征性成分之一[6]。現代藥理研究表明，CMP具有抗高血壓、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、降血糖、抑制脂肪細胞分化等功效[7-10]。雖然CMP藥理作用的研究較多，但關于CMP對α-黑素細胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone, α-MSH)誘導的B16細胞內黑色素生成抑制作用及機制的研究仍然缺乏。因此，本實驗以小鼠B16細胞為研究對象，構建α-MSH誘導的黑色素高表達細胞模型，以熊果苷為陽性對照，研究CMP對α-MSH誘導的B16細胞內黑色素生成的抑制作用，并初步探究其作用機制，以期為CMP在化妝品或藥品的應用提供科學依據。

1 材料

1.1細胞株小鼠黑色瘤B16細胞購于美國模式培養物集存庫(American Type Culture Collection, ATCC)。

1.2藥品與試劑胎牛血清、DMEM高糖培養基、胰蛋白酶(含0.05% EDTA)，均購自美國Gibco公司；熊果苷(純度98%)、左旋多巴、MTT、二甲基亞砜、PBS粉劑，均購自美國Sigma公司；cDNA合成試劑盒購自日本TaKaRa公司；TYR、TRP-1、TRP-2、MITF、β-actin抗體，均購自美國Cell Signaling Technology公司；所有的熒光二抗購自美國Jackson Immuno Research公司。

1.3儀器IX51型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；DL-CJ-1N型超凈工作臺(北京東聯哈爾儀器制造有限公司)；NU-8500型 CO2恒溫培養箱(美國Thermo公司)；ECOTM實時熒光定量PCR儀(美國Illumina公司)；SpectraMax-190型全波長酶標儀(美國Molecular Devices公司)。

2 方法

2.1CMP的制備將干燥的桑白皮粉碎成粉末，按照料液比1 ∶10 (g·mL-1)與70%乙醇溶液混合， 180 r·min-1室溫條件下振蕩提取3次，每次4 h。過濾后，合并3次提取液，用旋轉蒸發儀濃縮至適量，上大孔樹脂，吸附12 h，用蒸餾水洗脫，洗至Molish反應為陰性，再依次使用不同純度的乙醇沖洗，收集洗脫液，濃縮冷凍干燥，得CMP粉末。采用Folin-Ciocalteu法[11]，以單寧酸(tannic acid, TA)為標準品，繪制OD值(Y)與質量濃度(X)間的標準曲線為Y = 0.001X - 0.005(r2= 0.999)。根據標準曲線，計算CMP的含量(mg TA·g-1)。

2.2B16細胞培養及分組小鼠黑色瘤B16細胞置于含10%胎牛血清、青鏈霉素(100 kU·L-1)的DMEM高糖培養基(pH=7.2)中培養，培養條件為37℃、5% CO2且相對飽和濕度，取對數生長期的細胞用于后續實驗。實驗設置空白對照組(Control)、α-MSH模型組(Model)、陽性對照組(α-MSH誘導+熊果苷100 mg·L-1)、CMP組(α-MSH誘導+CMP 5、10、20 mg·L-1)。

2.3細胞活力的測定采用MTT法[12]測定細胞活力。取B16細胞以1×108·L-1接種于96孔板中，每孔100 μL，24 h后按照實驗分組加入不同藥液，CMP的終濃度為5、10、20 mg·L-1，每組設4個復孔。培養24 h，各孔加入5 g·L-1的MTT溶液20 μL，3 h后輕輕吸去上清液，每孔加入200 μL DMSO溶液，震蕩均勻，于570 nm波長處測各孔的吸光值。按下列公式計算細胞相對活力：細胞相對活力/%=實驗組吸光值/空白對照組吸光值×100%。

2.4細胞內黑色素含量的測定采用NaOH裂解法測定細胞內黑色素的含量[13]。取B16細胞以5×107·L-1接種于12孔板中，每孔1 mL，培養24 h。按照實驗分組加入0.2 μmol·L-1α-MSH進行誘導(除空白對照組)，構建α-MSH誘導的黑色素高表達細胞模型，再加入不同藥液，其中CMP的終濃度為5、10、20 mg·L-1，陽性對照熊果苷的終濃度為100 mg·L-1，每組設4個復孔。培養48 h后，棄去上清液，用PBS清洗3次后，每孔加入200 μL 1 mol·L-1的NaOH溶液(含10% DMSO)，在80℃條件下充分裂解細胞1 h，于475 nm波長處測各孔的吸光值。溶液中蛋白質含量的測定采用Bradford法。按照同法，以黑色素為標準品，繪制OD值(Y)與質量濃度(X)間的標準曲線：Y = 0.009X + 0.00008 (r2=0.992)，通過標準曲線計算細胞內黑色素的含量。按下列公式計算細胞內黑色素相對含量：細胞內黑色素相對含量/%=實驗組每克蛋白質中的黑色素含量/α-MSH模型組中每克蛋白質中的黑色素含量×100%。

2.5細胞內酪氨酸酶活性的測定采用L-Dopa氧化法測定細胞內酪氨酸酶的活性[14]。細胞分組處理同“2.4”，培養48 h后，棄去上清液，用PBS清洗3次，每孔加入含1% TritonX-100的PBS緩沖液500 μL，置于-80℃冰箱中冷凍1 h，隨后室溫融化，將細胞裂解液在12 000 r·min-1、4℃條件下離心20 min，收集上清液。取上清液60 μL于96孔板中，加入140 μL的5 mmol·L-1L-Dopa，37℃孵育1 h，于405 nm波長處測各孔的吸光值。溶液中蛋白質含量的測定采用Bradford法。按下列公式計算細胞內酪氨酸酶相對活性：細胞內酪氨酸酶相對活性/%=實驗組每克蛋白質中的酪氨酸酶活性/α-MSH模型組中每克蛋白質中的酪氨酸酶活性×100%。

2.6TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白表達的測定采用不同濃度CMP(5、10、20 mg·L-1)處理B16細胞，48 h后裂解細胞，提取細胞總蛋白。Bradford法測定蛋白質濃度，按每個電泳孔道加入30 μg蛋白，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干式轉移至PVDF膜。分別加入TYR、TRP-1、TRP-2、MITF、β-actin的一抗(1 ∶1 000)進行免疫印跡，再用1 ∶5 000稀釋的相對應二抗進行雜交。采用ELC反應，暗室顯影，曝光。Bio-Rad軟件分析各電泳條帶的蛋白量，結果表示為各電泳條帶的灰度值與β-actin灰度值的比值。

2.7TYR、TRP-1、TRP-2、MITFmRNA表達的測定采用不同濃度CMP(5、10、20 mg·L-1)處理B16細胞，48 h后利用TRIzol試劑提取總RNA，然后采用PrimeScriptTMRT試劑將RNA逆轉入為cDNA。加入SYBR Green、引物及cDNA模板，進行實時熒光定量PCR反應。引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences used for TYR, TRP-1, TRP-2, MITF detection with qRT-PCR primers

3 結果

3.1CMP對細胞活力及α-MSH誘導的細胞黑色素含量的影響由Fig 1A可知，B16細胞經不同濃度CMP(5、10、20 mg·L-1)處理24 h后，CMP對細胞活性沒有明顯影響，與空白對照組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。表明后續實驗均可采用此濃度進行研究。構建α-MSH誘導的黑色素高表達細胞模型，觀察CMP作用后細胞內黑色素生成量的變化。由Fig 1B可知，B16細胞經α-MSH誘導后，細胞黑色素的生成量明顯增加(P<0.05)，表明α-MSH誘導的黑色素高表達細胞模型建立成功。與α-MSH模型組相比，陽性對照熊果苷作用后，對細胞內黑色素生成的抑制率達到(17.29±3.31)%；而CMP在濃度為20 mg·L-1時，對細胞內黑色素生成的抑制率達到了(52.95±0.63)%，與α-MSH模型組相比，差異具有顯著性(P<0.05)，說明CMP對黑色素生成的抑制效果強于陽性對照熊果苷。

3.2CMP對α-MSH誘導的細胞內酪氨酸酶活性的影響如Fig 2所示，CMP和陽性對照熊果苷對B16細胞內酪氨酸酶活性均呈現出明顯的抑制作用，酪氨酸酶活性隨著CMP濃度的升高而降低，且呈劑量依賴性。與α-MSH模型組相比，當CMP濃度為10、20 mg·L-1時，對細胞內酪氨酸酶活性的抑制率分別為(17.43±1.06)%、(32.85±1.17)%，差異具有顯著性(P<0.05)；而熊果苷對細胞內酪氨酸酶活性的抑制率為(16.75±0.43)%，說明陽性對照熊果苷的作用效果沒有桑白皮多酚的效果明顯。結果表明，CMP在一定程度上通過抑制細胞內酪氨酸酶的活性，抑制黑色素的產生。

Fig 1 Effect of CMP on cell viability (A) and α-MSH induced melanin content (B) in B16 cells n=3)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

Fig 2 Effect of CMP on α-MSH induced tyrosinase activity in B16 cells n=3)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

3.3CMP對細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITFmRNA表達的影響由Tab 2可知，與空白對照組相比，B16細胞經α-MSH誘導后，細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA的表達水平均明顯升高，分別是空白對照組的2.63、2.04、1.92、7.41倍。CMP明顯抑制了α-MSH誘導的細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA的表達水平，隨著CMP濃度的增加，抑制效果呈濃度依賴性增加，且有統計學差異(P<0.05)。與α-MSH模型組相比，當CMP濃度為20 mg·L-1時，對細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA表達的抑制率分別73.31%、59.32%、58.56%、83.95%。

Tab 2 Effect of CMP on α-MSH induced TYR, TRP-1, TRP-2, MITF mRNA levels in B16 cells n=3)

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.4CMP對細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白表達的影響Fig 3的Western blot結果顯示，B16細胞經α-MSH誘導后，細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白的表達明顯增加(P<0.05)。結果證實了B16細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITF表達量的升高，將促進黑色素的生成。當CMP濃度為10、20 mg·L-1時，細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白表達量明顯低于α-MSH模型組，且差異具有顯著性(P<0.05)。結果表明，CMP能夠明顯下調α-MSH誘導的細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITF的蛋白表達。

4 討論

本研究以小鼠B16細胞為研究對象，構建α-MSH誘導的黑色素高表達細胞模型，首先研究了CMP對B16細胞活力的影響，結果顯示，CMP在濃度為5～20 mg·L-1時，對細胞無明顯毒性作用，可采用此濃度進行后續實驗。以熊果苷為陽性對照，本研究檢測了CMP對α-MSH誘導的細胞內黑色素含量及酪氨酸酶活力的影響。結果顯示，細胞經α-MSH誘導后，細胞黑色素生成量及酪氨酸酶活性明顯增加，與空白對照組比較差異具有顯著性，表明α-MSH誘導的黑色素高表達細胞模型建立成功。CMP對α-MSH誘導細胞內黑色素含量及酪氨酸酶活性均呈現出明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性。與陽性對照熊果苷相比較，CMP對黑色素含量及酪氨酸酶活性的抑制作用更明顯，表明桑白皮多酚的美白效果優于已被普遍認可的美白添加劑熊果苷。

本研究還進一步探討了CMP抑制黑色素生成的作用機制，分別采用Western blot和qRT-PCR測定B16細胞中TYR、TRP-1、TRP-2、MITF蛋白質和mRNA的表達。研究表明[15]，黑色素的生物合成含量與速度由TYR、TRP-1、TRP-2 3種黑色素細胞特異酶催化，其中TYR、TRP-1、TRP-2的異常表達會引起黑色素的大量生成，從而導致多種色素性皮膚病的發生，如皮膚斑點、白癜風、惡性黑色素瘤等。MITF是黑色素生成通路中另一個重要調控基因，MITF可以上調TYR基因的表達，從而促進黑色素的生成。本研究發現，CMP能夠明顯下調α-MSH誘導的細胞內TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA和蛋白表達水平。CMP可能通過抑制MITF基因的表達，下調了TYR、TRP-1、TRP-2的基因水平，進而抑制酪氨酸酶活性，抑制黑色素的生成。

Fig 3 Effect of CMP on α-MSH induced TYR, TRP-1, TRP-2, MITF protein levels in B16 cells n=3)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

綜上所述，本研究揭示了CMP能夠明顯抑制α-MSH誘導黑色素的生成，其機制可能是通過調控TYR、TRP-1、TRP-2、MITF mRNA和蛋白表達，進而抑制酪氨酸酶活性實現的。這些結果有望為CMP在化妝品或藥品的應用提供一定的科學依據。

(致謝：本實驗主要在安徽省黃山學院生態與健康技術中心和韓國安東國立大學食品科學與生物技術國家重點實驗室完成，感謝胡長玉、萬志兵老師、郭孝成、盧瑋瑋、戴毅等同學的幫助，在此致以真誠的感謝。)