HPLC法測定保健食品中抗壞血酸的組成及穩定性

劉成浩，張蓉，鄔國慶，杜勇，楊玲，劉齊，韓蕭茜，張華珺

（北京市藥品檢驗所，北京102200）

抗壞血酸有兩種同分異構體，分別為L（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸。L（+）-抗壞血酸具有強還原性，對人體具有生物活性，可以防治壞血病，并且在過敏性皮膚病、肝炎等疾病上也有治療作用。但L（+）-抗壞血酸不能在人體內合成，需要從外界攝取，因此廣泛應用于保健食品中。另外L（+）-抗壞血酸極不穩定，遇空氣中氧、熱、堿等會被氧化成脫氫L（+）-抗壞血酸，被氧化后的L（+）-抗壞血酸在人體內活性大大降低；D（+）-抗壞血酸又稱為異抗壞血酸，雖然抗氧化性強于L（+）-抗壞血酸，但是對人體基本無生物活性，攝入過多會引起尿酸結石、多尿、皮疹等[1-10]，因此，國家食品藥品監督管理總局發布的《營養素補充劑原料目錄》（2016年第205號公告）中明確規定D（+）-抗壞血酸不能用于保健食品中。

目前測定抗壞血酸含量的方法中熒光法及滴定法應用較廣泛，然而熒光法操作繁瑣，穩定性較差；滴定法易受樣品顏色干擾，誤差較大[11-17]。并且上述方法只能測定樣品中天然存在或添加的抗壞血酸總量，無法分別出保健食品原料添加的是L（+）-抗壞血酸還是D（+）-抗壞血酸，由于國家規定 D（+）-抗壞血酸不能用于保健食品中，因此應用上述方法均不能對保健食品市場進行有效監管，保健食品原料添加情況存在一定風險。2016年8月31日頒布實施的《食品安全國家標準-食品中抗壞血酸的測定》（GB 5009.86-2016）[18]對于抗壞血酸含量測定新增了高效液相色譜法，此方法可以同時測定食品中抗壞血酸兩種同分異構體L（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸。但是，日常監管檢測中發現標準給出的實驗條件應用于保健食品時不能很好的分離兩種同分異構體并且操作步驟復雜，故本文探討了不同色譜條件下兩種同分異構體的分離情況，對方法進行了優化，發現采用資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE-AQ耐水柱，以磷酸二氫鉀溶液-甲醇（98∶2）為流動相，無需控制pH即可較好分離L（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸并分別準確測定其含量，方法簡便重復性好。優化后的方法可以很好地測定保健食品中抗壞血酸的含量并檢測保健食品廠家原料中是否違規添加D（+）-抗壞血酸，為日常監管消除了風險。同時此方法還可分析保健食品中L（+）-抗壞血酸的穩定性[19-22]，通過此方法考察保健食品不同劑型L（+）-抗壞血酸穩定性可以為企業改進生產方法作為參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（1260 Infinity）：Agilent；電子天平（XS205）：Mettle。

甲醇（色譜純）：德國默克。磷酸二氫鉀、L-半胱氨酸（均為優級純）、磷酸、偏磷酸、磷酸三鈉（均為分析純）：國藥集團。十六烷基三甲基溴化銨（色譜純）：SIGMA公司。

L（+）-抗壞血酸對照品：（來源：Dr.Ehrenstorfer GmbH 純度：98.9%批號：103944）。D（+）-抗壞血酸對照品（來源：TRC 純度：98%批號：1-AGE-94-1）。

1.2 方法

1.2.1 標準品溶液制備

精密稱取 L（+）-抗壞血酸對照品 10 mg和 D（+）-抗壞血酸對照品10 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液溶解并稀釋至刻度。精密量取上述對照品儲備液 0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mL 分別置于10 mL棕色容量瓶中，加20 g/L偏磷酸溶液稀釋至刻度，搖勻備用。

1.2.2 供試品溶液的制備

在避光條件下，取本品20片研細混勻，精密稱取0.2 g，置于50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液溶解并定容，搖勻后過濾，棄去初濾液，從續濾液中精密吸取2.0 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液稀釋定容至刻度，混勻。0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液上機測定L（+）－抗壞血酸和D（+）－抗壞血酸的含量。

1.2.3 供試品中脫氫抗壞血酸的還原

從1.2.2供試品溶液中精密吸取2.0 mL，置于50 mL離心管中，用20 g/L偏磷酸溶液補至20 mL，加入40 g/L的L－半胱氨酸溶液10 mL，用100 g/L磷酸三鈉溶液調節pH值至7.1，以200次/min振蕩5 min。再用磷酸調節pH值至4.5，用水將試液全部轉移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，混勻。0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液上機測定L（+）－抗壞血酸總量，其中包含抗壞血酸和脫氫抗壞血酸，并由此可推算出抗壞血酸氧化程度。

1.2.4 色譜條件

色譜柱：資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ柱，柱長 250 mm，內徑 4.6 mm，粒徑 5 μm；流動相：磷酸二氫鉀溶液（取13.600 g磷酸二氫鉀和1.821 g十六烷基三甲基溴化銨，加水溶解并定容至2 000 mL，用 0.45 μm 微孔濾膜濾過即得）－甲醇（98∶2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長為 245 nm；進樣量 20 μL。理論板數應大于2 000，各峰分離度應大于2。

2 結果與分析

2.1 液相條件的確定

2.1.1 色譜柱的選擇

本試驗中選用3根不同的色譜柱，分別為資生堂CAPCELLPAKC18TYPE－AQ、安捷倫ZORBAXSB－Aq、德國MN C18柱，按1.2.4中色譜條件分別進行試驗，考察不同色譜柱對色譜分離的影響，其色譜圖見圖1。

圖1 對照品色譜圖Fig.1 Chromatogram of reference substance

結果表明資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ色譜柱分離度較好，不同色譜柱的分離度見表1。

表1 色譜柱對色譜分離的影響Table 1 The influence of chromatogram by column

表1表明，資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ色譜柱分離效果最好（色譜圖見圖1），因此采用資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ為本實驗色譜柱。

2.1.2 流動相的pH值對色譜分離的影響

以磷酸二氫鉀溶液－甲醇（98∶2）為流動相，改變其pH值，考察pH值對L（+）－抗壞血酸和D（+）－抗壞血酸色譜行為的影響。結果見表2。

表2 pH對色譜分離的影響Table 2 The influence of chromatogram by pH

表2表明，流動相pH值為4.0、4.5、5.0時分離度均滿足要求，且當流動相按上述方法配制后pH值為4.5，在不改變pH值的條件下即可很好的分開抗壞血酸兩種同分異構體。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性關系

取 1.2.1 中 L（+）－抗壞血酸和 D（+）－抗壞血酸標準品溶液，在1.2.4色譜條件下用高效液相色譜儀測定，記錄色譜圖，經統計學處理得線性回歸方程L（+）－抗壞血酸：A=45.09 C－83.71，相關系數 r=0.999 7；D（+）－抗壞血酸：A=43.26C－64.30，相關系數 r=0.999 9。表明兩種抗壞血酸同分異構體在2 μg/mL～100 μg/mL濃度范圍內，峰面積與濃度均呈良好的線性關系。

2.2.2 精密度實驗

取1.2.1標準曲線中第3點（10 μg/mL濃度）重復進樣5次，記錄色譜圖，計算RSD值為L（+）－抗壞血酸：1.1%；D（+）－抗壞血酸 1.5%。

表3 精密度測定結果Table 3 The results of precision

2.2.3 加標回收實驗

取已知含量的供試品（含量為L（+）-抗壞血酸：2.69×104mg/100 g；D（+）-抗壞血酸：0 mg/100 g；按1.2.3測定 L（+）-抗壞血酸總量為 2.79×104mg/100 g）研細混勻后，精密稱取 0.100 3、0.101 7、0.100 8 g，分別置于50 mL棕色容量瓶中，精密稱取L（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸對照品各30 mg，置于上述50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液溶解并定容，搖勻后過濾，棄去初濾液，從續濾液中精密吸取2.0 mL，置于50 mL棕色容量瓶中，用20 g/L偏磷酸溶液稀釋定容至刻度，混勻。0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液上機測定L（+）-抗壞血酸和D（+）-抗壞血酸的加標回收率。

從上述續濾液中精密吸取2.0 mL，置于50 mL離心管中，用20 g/L偏磷酸溶液補至20 mL，加入40 g/L的L-半胱氨酸溶液10 mL，用100 g/L磷酸三鈉溶液調節pH至7.1，以200次/min振蕩5 min。再用磷酸調節pH至4.5，用水將試液全部轉移至50 mL容量瓶中，并定容至刻度，混勻。0.45 μm微孔濾膜濾過，濾液上機測定L（+）-抗壞血酸總量的加標回收率。加標回收率結果見表4。

表4 回收率結果Table 4 The results of recoveries

2.3 市售保健食品中抗壞血酸的分析研究

2.3.1 對于市售保健食品中抗壞血酸組成的分析

由于保健食品營養素補充劑原料中不包括D（+）-抗壞血酸，因此隨機抽取市售保健食品中銷量較大的30個廠家的品種，在本文條件下進行試驗，考察其中抗壞血酸成分的組成，發現均未檢出D（+）-抗壞血酸，因此可認為這30批次樣品均為合格產品。

2.3.2 保健食品中L（+）-抗壞血酸穩定性的分析

隨機抽取市售保健食品不同劑型的10批次產品進行穩定性試驗，在溫度為25℃，相對濕度為50%的條件下放置12個月，分別在3、6、9、12個月時取樣測定其L（+）-抗壞血酸的含量，取0月的樣品進行1.2.3中供試品還原的操作，測定L（+）-抗壞血酸總量，以此比較出保健食品中抗壞血酸的氧化程度。結果見表5。

表5表明，大部分儲存 3、6、9、12月后的產品L（+）-抗壞血酸氧化程度較小，而軟膠囊和口服液中抗壞血酸含量隨時間延長含量有所降低，氧化程度均接近40%，由此推測在適宜的儲存環境下固體產品穩定性較好，液態產品穩定性稍差。

表5 L（+）-抗壞血酸穩定性的分析Table 5 The analysis of stability

3 結論與討論

1）本試驗通過考察不同pH值對測定結果以及L（+）－抗壞血酸和D（+）－抗壞血酸分離度的影響，發現國標中給出的pH2.5～2.8條件下分離度不能滿足R≥1.5，而按照本文1.2.4中條件配制流動相時，其pH值為4.5不需要再進行調節pH值的步驟即可滿足分離度R≥1.5，簡化了國標方法的同時優化了試驗條件。

2）本試驗中考察了3根不同的色譜柱，分別為資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ、安捷倫ZORBAX SB－Aq、德國MN C18柱。結果表明資生堂CAPCELL PAK C18 TYPE－AQ柱耐水性較好，分離效果最好，故采用此色譜柱作為本試驗的色譜柱。

3）由于抗壞血酸極易氧化，所以試驗中用水均為新沸晾涼后的水，并且在避光條件下進行試驗，以減少抗壞血酸氧化對結果的影響。通過本試驗方法可以對保健食品中抗壞血酸的穩定性進行研究，采用1.2.3中方法將樣品進行還原測定其L（+）－抗壞血酸總量，與直接測定的L（+）－抗壞血酸含量進行比較從而判斷產品中抗壞血酸的被氧化程度。研究中發現目前大部分保健食品在正常儲存環境下抗壞血酸較穩定，個別產品中L（+）－抗壞血酸被氧化程度較高，其中液態產品穩定性較固態產品差，可能由于產品包裝透光性較強，密封不嚴以及液態環境下更有利于抗壞血酸分解所致，因此建議廠家可改用片劑或泡騰片等劑型。

4）目前，國家標準中抗壞血酸的含量測定有滴定法，熒光法及HPLC法3種，熒光法操作繁瑣，穩定性較差；滴定法易受樣品顏色干擾，誤差較大；新增的HPLC法相較于前兩種方法優勢在于穩定性好重復性高，并且可以分離 L（+）－抗壞血酸和D（+）－抗壞血酸兩種異構體，由此可應用于保健食品中抗壞血酸組成的測定，從而監督保健食品廠家是否添加了營養素補充劑原料中不允許添加的D（+）－抗壞血酸。與此同時，此方法還可以測得L（+）－抗壞血酸被氧化程度，而被氧化的L（+）－抗壞血酸對人體活性較小，可以利用此方法研究L（+）－抗壞血酸在保健食品的不同制備及存儲條件下的穩定性從而選擇最優方案，使產品質量控制得到更好的提升。