冷卻豬肉中降膽固醇假單胞菌的篩選與鑒定

王京，張明贊

（貴州工業職業技術學院，貴州貴陽550025）

假單胞菌（Pseudomonas.spp）是一種外形為直或稍彎的革蘭氏陰性桿菌，也是一種嚴格好氧菌、從不發酵的無核細菌。導致冷卻肉類腐敗變質的主要微生物有多種，假單胞菌是其一[1－2]，占肉類腐敗微生物的25%～26%。田璐等[3]研究表明，假單胞菌利用肌氨酸的能力比較強，促使了需氧型假單胞菌在有氧條件下大量繁殖，因而引起冷卻肉腐壞[4]。假單胞菌需要足夠的碳源與能源才能存活。冷卻豬肉含有豐富的碳源和能源，是我國和國外日常生活主要的肉類食品之一[5]。冷卻豬肉因其保質期長，柔軟多汁，口感細膩、鮮美，是豬肉產業的發展趨勢[6]。在低溫貯藏條件下，導致肉類腐壞的微生物中，假單胞菌占很大比重[7]。因此，越來越多的研究更加關注的是假單胞菌作為腐敗菌研究，而對假單胞菌的其他功能性研究還不夠深入。

目前，隨著人們的生活質量不斷提高，膳食營養亦日益豐富，患高脂血癥等心腦血管疾病的機率也增大了。最新流行病學調查報告[8]表明膽固醇水平每降低1%，冠心病的發病率就會降低2.5%，因此科研工作者們爭相研究怎樣才能降低人體血清的膽固醇含量。目前，人們通常用3種方式來調節人體內血清的膽固醇量，一是控制食品中膽固醇的攝入量，二是抑制膽固醇在體內的合成，三是促進體內膽固醇的轉化及排泄。最近，科學家們發現膽固醇的代謝與假單胞菌有關，主要是假單胞菌能產生一種降膽固醇脂酶的作用[9－10]。目前我國主要是從國外引進假單胞菌，因此有必要篩選出具有自主知識產權的降膽固醇假單胞菌菌株，而從冷卻豬肉中篩選出新菌株比較容易。本研究主要從冷卻豬肉中篩選一株假單胞菌株，使用鄰苯二甲醛法測量菌株在降膽固醇方面的能力，并對耐酸性進行評估，為以后開發降膽固醇假單胞菌的食品藥品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

依據國標GB/T 9959.2－2008《鮮、凍片豬肉》中要求，樣本都是從超市購買后，貯藏特定溫度范圍（0℃～4℃）內，在2 h之內帶回實驗室。

假單胞菌培養基[11]：c－f－c 選擇劑 0.1 g，酵母粉 3 g，吐溫80和NH4NO3、膽固醇、牛肉膏各1 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O和KH2PO4各0.25 g，FeSO40.001 g，培養基的pH值調節為7.0±0.2；蒸餾水1 000 mL。

改良PTYG培養基（胰蛋白胨酵母培養基）[12]：吐溫80 1 mL，鹽溶液40 mL，葡萄糖和酵母提取物各10 g，L－半胱氨酸鹽酸鹽 0.5 g，瓊脂粉 15 g，大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨5 g、低聚果糖5 g，將各成分用蒸餾水1 000 mL，煮沸去除氧氣，高溫滅菌（121℃）20 min。

改良PTYG液體培養基：吐溫80 1 mL，鹽溶液40 mL，葡萄糖和酵母提取物各10 g，L－半胱氨酸鹽酸鹽0.5 g，大豆蛋白胨5 g、胰蛋白胨5 g、低聚果糖5 g，將各成分用蒸餾水1 000 mL，煮沸去除氧氣，高溫滅菌（121℃）20 min。

PTYG瓊脂培養基（含有 5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D半乳糖苷）：在改良PTYG培養基中加入X－gal（40 mg/L）[13]，X－gal放于－20℃避光保存，高溫會分解，用滅菌水稀釋至20 mg/mL，每個改良的PTYG瓊脂平板涂布40 μL，現配現用。

降膽固醇培養基：加入膽固醇膠束溶液，使改良PTYG液體培養基成為含有膽固醇濃度為0.1 mg/mL的降膽固醇培養基。含有0.1 mg/mL膽固醇膠束溶液的1 000 mL的液體培養基的配制：（1）分析天平精確稱取膽固醇0.1 g；（2）依次加入蔗糖八乙酸酯0.1 g，膽鹽 0.2 g，吐溫 80 1 mL，攪拌均勻；（3）加入 5 mL 冰乙酸加熱溶解，超聲15 min；（4）迅速加入到配好的改良PTYG液體培養基中，同時攪拌均勻，使其成為均一穩定的膠體溶液，121℃滅菌20 min。

膽固醇標準液的配制（1 mg/mL）：精密稱取0.05 g（精確至0.01 mg）膽固醇（色譜純）標品，放入小燒杯中，再加入10 mL無水乙醇，待完全溶解后定容至50 mL，即得1 mg/mL的膽固醇母液，4℃保存。

鄰苯二甲醛（O－phthalaldehyde，OPA）試劑的配制（0.5 mg/mL）：精密稱取 0.05 g（精確至 0.01 mg）鄰苯二甲醛，放入燒杯中，再加入20 mL的冰乙酸，待完全溶解后定容至100 mL，常溫避光保存，注意現配現用。

1.2 儀器與設備

MLS－3750高壓蒸汽滅菌鍋：三洋（SANYO）有限公司；SPX－250BY－III生化培養箱：常州恒隆儀器有限公司；FA2004電子天平：上海方瑞儀器有限公司；SWCJ－1D超凈工作臺：北京永光明醫療儀器有限公司；902－ULTS超低溫冰箱：賽默飛世爾科技（中國）有限公司；CX21SF1奧林巴斯生物顯微鏡：奧林巴斯中國有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種分離篩選與鑒定

分離篩選：稱取5.0 g冷卻豬肉，放入錐形瓶，再向其中加入50 mL無菌生理鹽水，再加入4顆小玻璃珠，在溫度為37℃、轉速設置為180 r/min的條件下振蕩培養30 min，吸取5 mL振蕩后溶液加入富集培養基（250 mL三角瓶裝液量為50 mL）中，同樣條件下搖床富集培養24 h。取0.2 mL稀釋適當梯度的富集懸浮液涂布于假單胞菌培養基上，靜置5 min后，平板倒置放于培養箱培養24 h，溫度設置為37℃。將形成單一菌落，劃線純化后劃Z形線保藏于斜面培養基上，37℃條件下培養1 d或2 d直到斜面出現豐滿的菌落后，放于4℃冰箱保藏，菌株編號為JXJ。

生理生化實驗初步鑒定：篩選出耐酸耐膽鹽受性好且膽固醇去除率高的菌株，利用糖發酵鑒定管和對碳源的利用[14－15]鑒定并觀察記錄結果，本試驗中采用的糖發酵鑒定管中主要有13種糖（分別為D－核糖、無糖對照管、纖維二糖、棉籽糖、松三糖、麥芽糖、甘露糖、乳糖、D－阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、葡萄糖鹽酸鹽、淀粉）。

分子鑒定：利用傳統的菌種鑒定方法如菌落特征、形態特征、生理生化特征[16]和16S rRNA、recA基因序列分析對菌種進行準確的分類鑒定，并構建系統進化樹（用MEGA5.0生物學軟件），采用鄰近相連算法（Neighbor－joining）對該菌株的16S rRNA序列進行分析，初始值設定為1 000次，之后在樹枝上對自展值進行標記，從而確定出菌株的種類[17]。

1.3.2 菌落形態特征及細胞形態特征觀察

樣品經處理后培養，由其形成菌落的形態和顏色篩選后用革蘭氏染色法進行處理，然后用顯微鏡觀察，先用低倍鏡找到菌落，再換用高倍鏡觀察單個細菌形態特征，同時做好記錄。挑菌，原則是挑選菌落較小、表面光滑、邊緣整齊、呈乳白色且質地柔軟的單一菌落，將挑出的菌落在改良的PTYG的瓊脂培養基上純化，通常傳代4次后，可以得到純化菌株，編號記錄，并用甘油凍存于-80℃。

1.3.3 繪制鄰苯二甲醛法（OPA）標準曲線

設置6個清潔試管，分別吸取0.02、0.05、0.10、0.12、0.15、0.20 mL的膽固醇標準液置于其中，再分別加入無水乙醇，使試管中溶液體積為1 mL，數據見表1，在各試管中加入4 mL的OPA試劑，在室溫條件下放置10 min。然后向其中緩慢加入4 mL的濃硫酸，為使其充分混勻，用振蕩器振蕩20 s，完成后放置于黑暗條件下10 min，最后測其在550 nm處的吸光值，以吸光值為x軸，膽固醇濃度為y軸繪制標準曲線，擬合出線性回歸方程。用1 mL無水乙醇作為空白對照組。

表1 膽固醇標準曲線數據表Table 1 Data list of cholesterol standard curve

1.3.4 假單胞菌待測液的準備

將之前凍存的純化菌株進行復蘇，方法是將取出的菌株迅速放入37℃的水浴鍋中，可適當晃動以使其快速融化，再用移液槍吸取100 μL滴在改良的PTYG液體培養基上，用玻璃棒涂布均勻，倒置放于CO2含量5%，濕度100%，溫度37℃的培養箱中，培養2天后，再進行挑菌，然后用平板劃線的方法進行純化，傳代3次后，接種在改良的PTYG液體培養基中，37℃搖床上進行搖菌，24 h后將菌液收集至離心管進行離心，計數，用磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer solution）重懸菌液，使菌體量為3×108CFU/mL，后將其按接種量為10%（體積分數）接種于含有0.1 mg/mL膽固醇的PTYG液體培養基，搖床搖菌24 h后離心管收集菌液，離心后取上清，同時用適量PBS洗滌菌落2次，每次洗滌液可轉入上清，一同作為待測液用于測定膽固醇的去除率，并同時設置空白對照，即空白的未添加菌落的膽固醇培養基。假單胞菌降膽固醇率S按公式（1）計算：

式中：S為膽固醇去除率，%；A為未接種菌株的含有膽固醇的PTYG液體培養基中膽固醇的含量，mg/mL；B為待測上清液中膽固醇的含量，mg/mL。

1.3.5 耐酸實驗

將細菌懸液以接種量為5%（體積分數）分別接種于pH值7.0和3.0的改良PTYG液體培養基中（pH值用0.1 mol/LHCl或NaOH調節），搖勻后放入孵箱，靜置2 h，每組重復3次。再用滅菌后的生理鹽水按10倍的比例進行梯度稀釋，至適合濃度后，吸取100 μL均勻涂布于改良的PTYG固體培養基上，倒置于放入CO2孵箱，24 h后，進行計數。

菌株的存活率N按公式（2）計算：

式中：N為菌株存活率，%；N0為菌株的存活菌數（在pH值為3.0的PTYG液體培養基中培養2 h后）；N1為菌株的存活菌數（在pH值為7.0的PTYG液體培養基中培養2 h后）。

1.3.6 數據處理與統計分析

本試驗數據均由SPSS 20.0，OriginPro9.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌落與細胞形態

在平板上挑一株假單胞菌株，記：菌株JXJ。菌株的平板菌落形態如圖1。

圖1 純化菌落形態和鏡檢10×40倍Fig.1 Schematic of puried colonies morphology and microscopy

由圖1可知，菌落在假單胞菌培養基上的生長速度較快，菌落特征明顯，呈淡黃色半透明，近圓形，邊緣齊整，光滑稍隆起，菌落直徑1.5 mm～3.0 mm，經比對該株菌株與熒光假單胞菌（P.fluorescens）特征接近。根據以上形態及生理生化特征可知菌株JXJ的特征符合假單胞桿菌屬，初步鑒定它屬假單胞菌屬（Pseudomonas）。

2.2 假單胞菌降膽固醇能力

2.2.1 繪制OPA法測降膽固醇的標準曲線[16]

按照表1對不同濃度的膽固醇測定其在550 nm處的吸光值A550，標準曲線如圖2所示。

圖2 膽固醇標品的OPA標準曲線圖Fig.2 Standard curve of cholesterol measured by OPA

圖2表明了在0～0.20 mg/mL范圍內，當膽固醇濃度增加的時候，吸光值也隨著增加。根據圖2得出了膽固醇標準曲線的線性回歸方程y=4.926 4x-0.013 0，其相關系數R2=0.999 2。

2.2.2 菌株的膽固醇去除能力

將篩選到的JXJ株菌，純化后挑選10株菌，分別標注JXJ1、JXJ2、JXJ3、JXJ4、JXJ5、JXJ6、JXJ7、JXJ8、JXJ9、JXJ10。對膽固醇的去除能力用鄰苯二甲醛（OPA）法測定，得到菌株的降膽固醇能力見表2。

表2 不同菌株的體外膽固醇去除率的結果（M±SD，n=3）Table 2 Degradation rate of cholesterol of strains in vitro（M±SD，n=3）

由表2可知，10株假單胞菌膽固醇去除率均達到了5.00%以上，最高的是菌株JXJ7達到了7.01%，結果表明這10株菌都具備一定的降膽固醇能力，為進一步篩選出所需要的菌株，選擇膽固醇去除率最高的JXJ5、JXJ7、JXJ8 3株進行下一步耐酸受性實驗。目前，對菌株的膽固醇去除率研究主要體現在雙歧桿菌，而對假單胞菌的降膽固醇研究還處于探索階段[22]。

2.3 酸耐受性結果

隨著培養時間的延長，假單胞菌的數量在減少[16]，目前，主要用活菌體內增殖的方法來提高體內假單胞菌的數量。因為人體胃液的pH值通常維持在0.9～1.8左右[17]，當人體食用帶假單胞菌食品或者藥品時，假單胞菌會在小腸中發揮益生作用。在進食的過程中，因為每個人的身體素質不同，吃的食物也有差異，所以胃部的pH值通常會在1.8～6.0范圍內變化，但是一般在3.0左右。除此之外，人們所吃的食物一般會在胃中停留90 min，且腸道中不同部位的pH值會有所不同[17]。而假單胞菌生長的最適pH值在6.5～7.0之間，因此，本研究中對所篩選的菌株進行了酸耐受性的實驗，不同菌株的耐酸受性也會有差異，3株降膽固醇能力高的菌株其耐酸性能見表3。

表3 菌株耐酸性能結果（M±SD，n=3）Table 3 Strains’tolerance to low pH（M±SD，n=3）

由表3可知，3株假單胞菌在酸性條件下的存活率均在90%以上，表明這3株菌都具備一定的耐酸能力，而且耐酸能力較好。其中JXJ7的存活率最高，達到了96.13%。可以看出，酸性條件會在一定程度上抑制假單胞菌的生長，但存活率仍然高于95%，主要是因為菌株具有較強的耐酸性。近年來，假單胞菌的耐酸性廣受研究者的關注，研究結論表明與章茂林等[23]研究的假單胞菌的耐酸性一致。

2.4 菌株生理生化實驗初步鑒定

自篩菌株JXJ7的[19-20]鑒定結果如表4和表5，可以看出所篩選的假單胞菌有很好的生理生化效果，結合菌株的菌落形態、菌株形態特征和糖發酵實驗結果與GB/T 4789.29-2003《食品衛生微生物學檢驗椰毒假單胞菌酵米面亞種檢驗》及伯杰氏細菌鑒定手冊對照得到JXJ為動物假單胞菌。

表4 菌株JXJ的生理生化鑒定結果Table 4 The physiological and biochemical results of JXJ

續表4 菌株JXJ的生理生化鑒定結果Continue table 4 The physiological and biochemical results of JXJ

2.5 序列分析

將JXJ菌株的全部16S rRNA序列[21]分別提交到NCBI，通過Blast在線程序在GenBank數據庫中檢索與已刊登的16S rRNA序列同源性進行比較，下載同源性較高的菌株的序列，使用軟件MEGA 5.0對其進行分析，通過鄰近法對系統樹進行構建，并且Bootstrap1000次檢驗分子系統樹置信度獲得系統發育樹（見圖3）。

表5 JXJ生理生化特征-碳源利用Table 5 Physiological and biochemical characteristics（utilization of carbon sources）of the strain JXJ

圖3 基于JXJ的部分16S rRNA序列同源性構建的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree on the similarity of partial 16S rRNA sequence of the strain JXJ

從系統發育樹中可以看出，該菌所在的最大分支中其所包括的菌株均為假單胞菌，菌株JXJ的16S rRNA序列與Pseudomonas sp.HY13KR序列同源性在99%以上，且屬于同一個最小分支中，因此菌株JXJ的鑒定結果為動物假單胞菌乳亞種。

3 結論

在冷卻豬肉中所篩選的JXJ7為假單胞菌并具有很好的生理生化特性，其表面光滑，邊緣整齊且為半透明或不透明狀，經鏡檢多呈桿狀，菌落微小，為革蘭氏陰性菌株，假單胞菌的膽固醇去除率為7.01%，在pH3.0條件培養下，其存活率高達96.13%，具有很好的耐酸性。本研究為假單胞菌的預測和檢測提供了有效工具，研究假單胞菌作為相關藥品食品來降低體內的膽固醇提供了數據支撐，同時為開發降膽固醇假單胞菌的食品藥品奠定基礎。