亞致死劑量高效氯氰菊酯對蚯蚓體內生化指標的影響

趙麗倩, 仇愛鋒, 紀偉, 陳子雷, 莊惠生

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亞致死劑量高效氯氰菊酯對蚯蚓體內生化指標的影響

趙麗倩1, 2, 仇愛鋒2, 紀偉2, 陳子雷3, 莊惠生1*

1. 上海交通大學環境科學與工程學院, 上海 200240 2. 浙江清華長三角研究院, 浙江，嘉興 314006 3. 山東省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所, 山東，濟南 250100

采用接觸濾紙法, 測定蚯蚓經亞致死劑量高效氯氰菊酯染毒24 h、48 h和72 h后其體內蛋白含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量的變化, 探討不同染毒時間和暴露濃度對蚯蚓的毒性效應。結果表明, 在高效氯氰菊酯亞致死劑量下, 染毒24 h時蛋白含量在50 mg·L-1達到最大值, 而染毒72 h時蛋白含量在5 mg·L-1達到最大值, 表現為短時間內促進蛋白合成而長時間下抑制。高效氯氰菊酯對SOD和CAT活力的誘導作用明顯, SOD活力在低濃度激活, 高濃度抑制; CAT活力呈現出先升高后降低的趨勢; MDA含量誘導作用不明顯, 短時間內隨暴露濃度升高而升高, 但隨染毒時間延長趨于正常水平。因此SOD和CAT可作為蚯蚓受到氧化脅迫的指示指標, 而MDA無法作為指示指標。此外, 各生化指標對高效氯氰菊酯毒性效應的敏感性存在差異, SOD活力影響最大, CAT次之, MDA最小。

高效氯氰菊酯; 蚯蚓; 蛋白含量; 抗氧化酶; 丙二醛含量

1 引言

農業生產中不可避免需要使用農藥提高農作物產量, 農藥殘留是施用農藥后的常見現象[1]。擬除蟲菊酯是一類仿生合成的廣譜殺蟲劑, 能夠防治多種害蟲, 且殺蟲毒效比有機磷、有機氯和氨基甲酸酯類高10—100倍[2]。高效氯氰菊酯(Beta-cypermethrin), 是一類典型的擬除蟲菊酯類殺蟲劑, 不溶于水, 但溶于有機溶劑, 對動物具有神經毒性。關于高效氯氰菊酯的毒性機制目前尚未完全了解, 國際上主要有兩種觀點, 一種認為擬除蟲菊酯直接同神經膜上Na+通道相互作用而產生毒性[3]; 另一種認為存在其它的靶標或作用點。我國學者普遍認同第一種觀點。相關研究表明, 施用擬除蟲菊酯類農藥后, 僅有1%—2%的藥物發揮有效作用成分作用, 余下均進入環境中[4], 致使環境中農藥的大量殘留, 引起環境污染與食品安全等相關問題。

近年來, 農藥對環境危害研究主要著眼于陸生和水生動物[5-8]。蚯蚓作為典型的土壤動物, 其活動可改善土壤結構, 提高土壤透氣性及土壤中有機成分的降解轉化, 還可作為土壤污染評價的指示生物[9]。此外, 蚯蚓處于陸生食物鏈底層, 可富集多種重金屬和農藥, 再通過食物鏈傳遞影響高營養級生物。在土壤毒理實驗中, 試驗蚯蚓的選擇對于研究農藥對蚯蚓毒性的強弱具有極其重要性[10]。關于高效氯氰菊酯對蚯蚓體內的蛋白質含量和抗氧化酶活力的研究鮮有報道。生物機體內自由基的氧化與抗氧化酶通常處于動平衡狀態, 當體內自由基的清除酶和非酶系統被破壞, 這種動平衡失調時, 會導致機體損傷, 所以細胞內抗氧化酶活性改變與膜脂質過氧化損傷被認為是污染物作用的結果。因此, 抗氧化酶活力的變化是體現機體抗氧化能力的重要指標[11]。

本研究選取赤子愛勝蚓作為受試生物, 研究亞致死劑量下蚯蚓體內蛋白質含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力、過氧化氫酶(CAT)活力和丙二醛(MDA)含量的變化, 探討高效氯氰菊酯對蚯蚓的毒性效應, 以進一步認識高效氯氰菊酯的環境毒性, 為制定農藥環境安全標準提供科學依據。

2 材料與方法

2.1 試驗動物

赤子愛勝蚓(), 購自南京某專業蚯蚓養殖場, 對不同污染物具有中等敏感性(例: 銅染毒2 d、7 d和14 d后, 銅與MDA含量的相關系數分別為0.760、0.672和0.544)。試驗前經實驗室預培養一段時間, 選擇2 月齡以上、體形相似、體重約為200—300 mg, 生殖環帶明顯的性成熟的成年蚯蚓用于毒性試驗。試驗正式開始前, 按OECD準則方法[12], 利用氯乙酰胺檢查敏感性, 從中挑選14 d LC50值在10—50 mg·kg-1dw范圍內的蚯蚓進行試驗。

2.2 試驗試劑

99.5% 丙酮, 購自杭州雙林化工試劑廠, 分析純; 99.1% 高效氯氰菊酯標準樣品, 購自上海市農藥研究所。考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、SOD、MDA和CAT測定試劑盒, 均購自南京建成生物工程研究所。

2.3 實驗儀器

玻璃培養皿(d=9 cm); 恒溫培養箱(SPX-290, 上海比郎儀器有限公司); 冷凍離心機(H3018DR, 上海知信實驗儀器技術有限公司); 紫外分光光度計(Cary 100 UV-Vis, 安捷倫(中國)有限公司); 均質攪拌機(FJ200-S, 杭州齊威儀器有限公司); 雪花制冰機(MINI 20, 上海比郎儀器有限公司); 恒溫水浴鍋(DKS-28, 嘉興市中新醫療儀器有限公司); 超純水器(UPWS-I-20T, 杭州永潔達凈化科技有限公司)。

2.4 試驗農藥質量分數設計

由高效氯氰菊酯的急性毒性試驗結果可得, 赤子愛勝蚓的72 h 最高不致死濃度為50 mg·L-1, 據此設定高效氯氰菊酯的濃度分別為 5 mg·L-1、10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、50 mg·L-1。

2.5 試驗方法

2.5.1 樣本預處理

選擇性成熟的成年蚯蚓, 用超純水洗凈表面土壤后放入底部鋪有濾紙并潤濕的1 L燒杯中, 用保鮮膜封口并扎孔, 將燒杯置于(20 ± 1)℃, 濕度為80%—85%的恒溫培養箱中, 于暗處培養一晝夜, 用于去除蚯蚓腸道內雜物等[13]。

2.5.2 染毒試驗

在直徑為9 cm的玻璃培養皿中墊入直徑為9 cm雙層雙圈定性濾紙備用。試驗時分別加入4 mL相應濃度的農藥試驗溶液, 需注意將其均勻淋灑于雙層雙圈定性濾紙上。將培養皿在通風櫥中通風10 h, 待丙酮揮發后, 吸取4 mL的超純水均勻地潤濕濾紙。

染毒試驗時, 用超純水將清腸的蚯蚓沖洗干凈, 并用濾紙吸干其表面水分。在每個添加好試驗農藥的玻璃培養皿中放入5條蚯蚓。然后在玻璃培養皿的蓋子內側墊入已用3 mL超純水均勻潤濕的直徑為11 cm的雙圈定性濾紙, 將玻璃培養皿蓋好以保證在72 h的試驗過程中蚯蚓生活在溫度為20 ℃、濕度相對穩定的避光環境中。試驗組分為5個試驗梯度, 每個濃度做3次重復。試驗過程中不投喂食物, 定期觀察和記錄蚯蚓的中毒癥狀和行為, 在24 h、48 h和72 h分別采集實驗蚯蚓樣本測定蛋白質的含量和酶活力。試驗期間無蚯蚓死亡。

2.5.3 空白對照的試驗方法

空白試驗中, 吸取4 mL的丙酮溶液均勻淋灑于墊有雙層雙圈定性濾紙的玻璃培養皿中, 將其放入通風櫥10 h, 待丙酮揮發后, 吸取4 mL的超純水均勻地潤濕濾紙。

2.6 蛋白含量及酶活力或含量測定

2.6.1 蛋白含量的測定

準確秤量待測樣本的重量, 按1∶9的重量(g)∶體積(mL)比例加入生理鹽水, 用冷凍離心機將冰水浴條件下機械勻漿好的蚯蚓組織樣本在2500 r·min-1和 4 ℃條件下, 離心10 min。用生理鹽水將離心后蚯蚓樣本上清液再按1∶9稀釋成1%的組織勻漿, 待測。

蚯蚓各樣本蛋白含量的測定采用Bradford[14]方法, 以牛血清蛋白為標準蛋白, 利用分光光度計在595 nm處測定其吸光度。

2.6.2 SOD活力的測定

按照上述2.6.1 的方法進行樣本前處理并制成10%的蚯蚓組織勻漿。取離心后的上清液待測。蚯蚓各樣本SOD活力的測定采用黃嘌呤氧化法[15], 通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基, 使硝基藍四氮唑被還原成紫紅色的亞硝酸鹽, 利用光分光光度計在550 nm處測定其吸光度。

2.6.3 CAT活力的測定

按照上述2.6.1 的方法進行樣本前處理并制成5%的蚯蚓組織勻漿。蚯蚓各樣本CAT活力的測定采用紫外分光法[16], 鉬酸銨溶液和經CAT分解后殘留的過氧化氫反應后產生的淡黃色絡合物在紫外分光光度計405 nm處的吸收峰測定。

2.6.4 MDA含量的測定

按照上述2.6.1 的方法進行樣本前處理并制成10%的蚯蚓組織勻漿。MDA含量的檢測采用TBA法[17], 過氧化脂質降解產物中的MDA與硫代巴比妥酸(TBA)在酸性和高溫條件下形成紅色產物, 在532 nm處有紫外可見最大吸收峰。

2.7 數據處理

蚯蚓體內生化指標數值由多個蚯蚓試驗樣本的平均值得到。實驗數據采用Excel 和SPSS 18.0 軟件處理, 試驗結果以平均值±標準偏差(Mean ± SD)表示, 且各數據之間相關性分析由SPSS 18.0 軟件完成。

3 結果與討論

3.1 高效氯氰菊酯對蚯蚓體內蛋白含量的影響

圖1為蚯蚓經過5、10、20、40和50 mg·L-1高效氯氰菊酯溶液濃度梯度處理24 h、48 h和72 h后體內蛋白含量及變化。

高效氯氰菊酯單一染毒試驗中, 同一試驗處理組24 h、48 h和72 h之間有顯著差異(<0.05)。與空白對照組相比, 部分處理組蛋白含量變化極顯著(<0.01), 如染毒24 h和48 h(除50 mg·L-1)的各濃度處理組。染毒24 h時, 蚯蚓體內蛋白含量隨著暴露濃度的增加而升高, 并在50 mg·L-1時達到最高值, 此時蚯蚓體內蛋白含量為空白對照組的1.68倍。染毒48 h時, 蚯蚓體內蛋白含量在40 mg·L-1時達到最高值, 為空白對照組的1.49倍, 隨后蛋白含量降低。染毒72 h時, 蚯蚓體內蛋白含量隨著暴露濃度的升高而降低, 且在暴露濃度為50 mg·L-1時低于空白對照組。此外, 由圖1中蚯蚓體內蛋白含量的變化可以發現, 染毒24 h時, 在50 mg·L-1時出現蛋白含量最高值, 而在染毒72 h可以發現暴露濃度為5 mg·L-1時出現蛋白含量最高值, 可推斷低濃度、長時間染毒對蚯蚓體內蛋白含量變化的影響與高濃度、短時間的染毒產生的影響類似, 即暴露污染物的濃度和染毒時間決定了蚯蚓受外來污染物脅迫的機體損傷程度, 此發現與孫仕仙等[18]研究結果類似。

圖1 高效氯氰菊酯單一染毒24 h、48 h和72 h對蚯蚓體內蛋白含量的影響

染毒初期, 有毒物質經表皮大量進入蚯蚓體內, 破壞其機體功能和內分泌系統, 隨著農藥暴露濃度的升高, 短期內可能產生較多的應激蛋白, 從而引起其體內蛋白含量的升高[19]。高效氯氰菊酯暴露濃度和染毒時間延長, 可能增加蚯蚓其體內生產正常生理功能的蛋白質或者誘導產生一些可以與其絡合的蛋白質去應對農藥高效氯氰菊酯的污染負荷[20]。隨著染毒時間進一步延長, 胃毒和經表皮毒性持續共同作用, 破壞其蛋白質的產生來源, 造成蛋白含量的降低[21]。

3.2 高效氯氰菊酯對蚯蚓體內SOD活力的影響

圖2為蚯蚓經過5、10、20、40和50 mg·L-1高效氯氰菊酯溶液濃度梯度處理24 h、48 h和72 h后體內SOD活力及變化。

蚯蚓經高效氯氰菊酯處理后, 其體內SOD活力的變化基本一致, 不同試驗濃度組間蚯蚓SOD活力差異顯著(<0.05), 同一試驗處理組24 h、48 h和72 h之間差異顯著(<0.05)。主要表現為SOD活力與空白對照相比先降低, 然后逐漸升高, 再持續降低。與空白對照組相比, 各染毒處理組的SOD活力變化極顯著(<0.01)。與空白對照組相比, 各染毒處理組的SOD活力變化幅度更大。在3個測定時段中, 蚯蚓體內SOD活力的高低順序為: 48 h＞24 h＞72 h。染毒24 h, SOD活力在低濃度時升高, 在20 mg·L-1時達到最大值, 之后隨濃度升高而降低, 出現催化劑量反應, 促進SOD的產生去承擔農藥負荷, 這與唐學璽和張培玉等的研究結果類似[22], 即生物體受到環境污染物少量脅迫時, 會促進SOD的產生, 使得SOD活力會升高, 而當其受到毒物重度脅迫時, SOD活力往往會降低。染毒48 h后, 蚯蚓體內SOD活力呈現下降趨勢, 可能是SOD是蚯蚓進行抗氧化防御的第一道防御, 對氧化損傷比較敏感[23]。蚯蚓染毒后體內的SOD活力開始抵御氧化損傷并逐漸適應, 但隨著染毒時間的延長, 過度的氧化應激反應超出機體的抗氧化能力, 導致SOD活力的降低[24]。

3.3 高效氯氰菊酯對蚯蚓體內CAT活力的影響

圖3為蚯蚓經過5、10、20、40和50 mg·L-1高效氯氰菊酯溶液濃度梯度處理24 h、48 h和72 h后體內CAT活力及變化。

由圖3可見, 在低濃度短時間內, 蚯蚓體內CAT活力逐漸升高, 而高濃度長時間下CAT活力抑制。與空白對照組相比, 試驗周期內部分處理組CAT活力變化極顯著(<0.01): 如染毒24 h的10、20和40 mg·L-1, 染毒48 h的 20 mg·L-1濃度組, 其CAT活力均顯著高于空白對照組, 分別為對應空白對照組的1.23、1.24、1.24和1.16倍。而染毒48 h 的5和40 mg·L-1, 染毒72 h的50 mg·L-1濃度組, 其CAT活力顯著低于空白對照組, 分別為對應空白對照組的0.74、 0.88和0.81倍。染毒24 h時, 10、20和40 mg·L-1的高效氯氰菊酯可誘導蚯蚓體內CAT活力上升; 染毒48 h時, 蚯蚓體內CAT活力逐漸降低。染毒72 h時, 對蚯蚓體內CAT活力產生誘導升高溶液的濃度隨著染毒時間的延長而降低, 染毒48 h到72 h時, 處理組誘導作用濃度由20 mg·L-1降低到10 mg·L-1。蚯蚓抗氧化酶系統應對氧化損傷的主要機理是, SOD催化O2-和H+轉化為H2O2和O2, 隨后CAT又將H2O2轉變為H2O和O2[25]。染毒24 h后, SOD活力的提高可能增加了H2O2的累積, 刺激CAT活力上升; 而隨著染毒時間延長, 過量H2O2的積累也會抑制CAT活力, 從而造成CAT活力降低。

圖2 高效氯氰菊酯單一染毒24 h、48 h和72 h對蚯蚓體內SOD活力的影響

圖3 高效氯氰菊酯單一染毒24 h、48 h和72 h對蚯蚓體內CAT活力的影響

3.4 高效氯氰菊酯對蚯蚓體內MDA含量的影響

圖4為蚯蚓經過5、10、20、40和50 mg·L-1高效氯氰菊酯溶液濃度梯度處理24 h、48 h和72 h后體內MDA含量及變化。

圖4 高效氯氰菊酯單一染毒24 h、48 h和72 h對蚯蚓體內MDA含量的影響

MDA作為膜脂質過氧化的產物, 是細胞膜脂質過氧化程度及應激反應強弱的指示指標, MDA含量與機體損傷成正比[26]。由圖4可見, 蚯蚓經高效氯氰菊酯單一染毒初期, 各試驗處理組蚯蚓體內MDA含量出現明顯上升: 如染毒24 h時10、20、40和50 mg·L-1試驗處理組顯著高于空白對照組(< 0.01), 分別為對應空白對照組的1.28、1.37、1.80和1.89倍, 且各蚯蚓試驗濃度組間MDA含量變化幅度較大, 達17.84%—89.35%, 并在50 mg·L-1時達到最高值。這可能是由于污染物造成生物體內發生脂質過氧化和氧化應激效應, 但因其自身調節能力限制, 蚯蚓體內累積過量的氧化自由基, 引起其機體細胞功能缺失導致膜的過氧化, 并伴隨MDA含量增加[27]。染毒48 h, 由于體內污染物代謝物質的累積, 導致其體內MDA含量略有所增加。此外, 隨著染毒時間延長, 蚯蚓體內MDA含量變化幅度不大, 逐漸趨于平穩, 是因為多余的活性氧被抗氧化酶去除, 使得蚯蚓體內活性氧的產生和去除處于動平衡狀態[26], 染毒72 h, 試驗處理組和空白對照組的MDA含量均無明顯差異(>0.05)。蚯蚓遭受環境脅迫嚴重時, 氧化應激反應能引起生物機體內脂質總量的下降, 并且成分發生改變, 造成生物膜發生脂質過氧化[28]。由整個染毒時間來看, 蚯蚓體內MDA含量在高濃度組的波動幅度明顯大于低濃度組, 且MDA含量的變化是農藥濃度和染毒時間的綜合結果, 機體短時間內的自由基損傷可修復, 但長時間染毒造成的機體損傷無法修復。本試驗結果也側面表明外源污染物的加入可引起生物體內MDA含量增加的現象[29]。

4 結論

1)亞致死劑量高效氯氰菊酯染毒24 h, 蛋白含量在50 mg·L-1達到最大值, 而染毒72 h, 蛋白含量在5 mg·L-1達到最大值。可得出農藥對蚯蚓體內蛋白含量的影響表現為低濃度、長時間暴露與高濃度、短時間暴露的作用類似, 即暴露污染物的濃度和染毒時間決定了蚯蚓受外來污染物脅迫的機體損傷程度。

2)高效氯氰菊酯對蚯蚓體內抗氧化酶活力有影響, SOD活力在低濃度激活, 高濃度抑制; CAT活力呈現出先升高后降低的趨勢; MDA含量在短時間內隨暴露濃度升高而升高, 而后恢復正常水平。

3)高效氯氰菊酯作用下, 蚯蚓體內SOD、CAT和MDA的敏感性不同, SOD活力影響最大, CAT次之, MDA最小。試驗研究結果可為高效氯氰菊酯的土壤生態毒理診斷提供參考。

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Effects of beta-cypermethrin on the biochemical indices of earthworms under the sublethal dose

ZHAO Liqian1, 2, QIU Aifeng2, JI Wei2, CHEN Zilei3, ZHUANG Huisheng1*

1. School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China 2. Yangtze Delta Region Institute of Tsinghua University, Zhejiang, Jiaxing 314006, China 3. Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agricultural Products, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China

In this study, the filter paper contact method was conducted to investigate the toxic effects of beta-cypermethrin under the sublethal dose after 24 h, 48 h and 72 h to discuss the content of protein, superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activities and the content of Malondialdehyde (MDA) in earthworm () in different exposure time and concentration. Different changes in the tested earthworm of protein content, SOD, CAT activity and MDA content were observed for application of beta-cypermethrin. The results showed that the protein content reached the maximum at 50 mg·L-1in 24 h, while the protein content reached the maximum at 5 mg·L-1in 72 h under the sublethal dose of beta-cypermethrin. Protein content showed a time-dependent effect with the beta-cypermethrin: the protein content increased in short time, while it decreased in the long time compared to the controls. Results of exposure tests indicated that beta-cypermethrin had a promoting effect upon the induction of the activities of SOD and CAT in earthworm.The activity of SOD increased in the low concentration group, while it decreased in the high concentration group. The activity of CAT showed a trend of increasing at first and then decreasing during the exposure time. Nevertheless, it was not so obvious to the changes of MDA content, which increased with the exposure concentration in a short time and tended to normal level with the exposure time prolonged. Thus, SOD and CAT could be the indicators of oxidative stress in earthworm, and MDA could not. In addition, the biochemical indicators had different sensitivity to the toxic effects of beta-cypermethrin; SOD was the greatest, followed by CAT and MDA was the minimum.

beta-cypermethrin; earthworm; protein content; antioxidant enzymes; malondialdehyde content

10.14108/j.cnki.1008-8873.2018.04.008

X171.5

A

1008-8873(2018)04-065-07

2017-06-15;

2017-07-21

混合農藥聯合毒性效應與膳食攝入風險評估(ZR2016YL027); 生物標志物在杭州灣海域生態風險評估中的研究與示范(2016C34010)

趙麗倩(1988—), 女, 浙江嘉興人, 碩士研究生, 主要從事環境污染風險研究, E-mail: liqian_zhao@hotmail.com

莊惠生, 男, 博士, 教授, 從事環境評價研究, E-mail: hszhuang@sjtu.edu.cn

趙麗倩, 仇愛鋒, 紀偉, 等. 亞致死劑量高效氯氰菊酯對蚯蚓體內生化指標的影響[J]. 生態科學, 2018, 37(4): 65-71.

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