新型AMPA受體拮抗劑對腦梗死再灌注損傷的保護作用

許 位, 石秋艷， 孫 原， 李冬梅， 李 弘， 王翠蘭

缺血性腦卒中涉及多種病理生理過程[1～3]，其中興奮性氨基酸大量釋放是加重腦損傷的一個非常重要的環節，當腦動脈供血中斷、能量代謝障礙，引起突觸前神經末梢大量釋放興奮性氨基酸，同時由于興奮性氨基酸的滅活、再攝取障礙及其受體的過度激活，使神經元興奮性持續增高，引起神經元的損傷[4～6]。非競爭性AMPA受體拮抗劑他侖帕奈[7～10]，因其水溶性好，更易透過血腦屏障(blood-brain barrier)，能阻止Ca2+、Na+內流增加，從而增加細胞膜電位穩定性，阻礙興奮性氨基酸谷氨酸大量釋放而引起的AMPA受體過度激活，使神經元興奮性降低，目前他侖帕奈處于3期臨床試驗階段，主要用于抗癲癇治療，它是否對缺血性腦卒中有治療作用，國內目前還無相關實驗研究。

本實驗通過觀察不同組的大鼠腦梗死體積、神經功能損傷評分、海馬CA1區細胞形態變化，同時測定TAL亞組腦梗死周圍區caspase-3陽性細胞及梗死皮質區域神經元存活數量，探討他侖帕奈對大鼠急性腦梗死缺血再灌注損傷的保護作用及其可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 60只SD雄性大鼠，清潔級，體質量約250～300 g，由中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究動物實驗中心提供[許可證號：SCXK-(軍)2011-003]，在實驗室于安靜環境中進行2～4 w適應性飼養，自由飲水，正常飲食。術前3 h禁食，自由飲水。實驗前采用隨機數字表法隨機分組：假手術組(10只，Sham組)、模型組 (10只，MCAO組)、實驗組(40只，TAL組)。根據實驗組給藥時間的不同將TAL組再分為TAL 0 h組、TAL 1 h組、TAL 3 h組、TAL 5 h組，每組10只大鼠。

1.2 制備動物模型 大鼠于術前禁食3 h，將水合氯醛(3.5 mg/kg)于大鼠內腹腔注射進行麻醉。采用改良Longa線栓法[11]制作大鼠急性缺血再灌注損傷模型，采用尼龍線栓(型號：2634-A4，北京西濃科技有限公司，中國)阻塞大鼠右側大腦中動脈，制備MCAO(middle cerebral artery occlusion)模型。在阻斷缺血2 h后，取出尼龍線栓，恢復血供。維持大鼠核心體溫在36 ℃～37 ℃。假手術組大鼠除不將尼龍線栓插至大腦中動脈外，其余手術過程與其它組相同。

1.3 給藥時間和劑量 大鼠MCAO模型制備成功后，實驗組根據設定的不同給藥時間點，通過大鼠尾靜脈給予他侖帕奈(12 mg/kg)注射，假手術組和模型組給予等量生理鹽水處理。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 腦梗死體積 每組5只大鼠用于TTC染色，在給藥24 h后斷頭處死大鼠，迅速取腦,去除低位腦干、小腦、嗅球等結構。將腦置于-20 ℃冰箱凍20 min。取出后自額極(Frontal pole)開始,做每間隔1 mm厚度腦冠狀連續切片。切取完畢后，將腦片放置于37 ℃的2%2,3,5-三苯基氯化四唑(TTC) (上海精析化工) 0.01 mol PBS 溶液中,孵育25 min，嚴格避光處理。結束后在4%多聚甲酸溶液(pH7.4)中固定過夜。采用微距相機拍攝,獲取圖片，根據蒼白區觀察梗死灶范圍，拍攝照片后,用Image-pro plus 6.0軟件對所拍攝的圖像進行分析(美國 Media Cybemetics公司)，統計并計算腦梗死體積。腦梗死體積百分比=腦梗死體積/全腦體積，通過計算腦梗死體積來衡量腦缺血的嚴重程度。

1.4.2 神經功能損傷評分(Longa 評分標準) 0分：活動自如，沒有明顯的神經功能損傷癥狀；1分：提尾時對側肢體伸展困難，不能完全伸展；2分：爬行時向對側轉圈；3分：爬行時向對側傾倒；4分：不能自主行走，無意識；5分：死亡。所有大鼠均參與神經功能損傷評分。

1.4.3 HE染色 利用光學顯微鏡觀察大鼠海馬 CA1區神經元的形態變化。

1.4.4 免疫組化檢測缺血半暗區 caspase-3的表達及梗死周圍區的神經元 每組5只大鼠用于免疫組化，給藥24 h后，立即處死斷頭取腦,制備石蠟切片，每份組織取4個切片，常規脫蠟至水,利用POD溶液阻斷，之后用5%的山羊血清封閉,并及時行抗原熱修復,PBS漂洗后依次滴加兔抗鼠單克隆 aspase-3抗體(1∶100,Affinity)，兔抗NeuN抗體(1∶200，Miliipore)，置于4 ℃整夜,使用0.01 PBS漂洗3次，每次10 min，滴加二抗：羊抗兔多克隆抗體(1∶100 北京中杉金橋生物技術公司)，于37 ℃保持1.5 h，用PBS 漂洗后進行DAB顯色。平均每張切片取5個視野，觀察并計數每個視野中表達caspase-3陽性細胞及皮質存活神經元的數量，并得到平均數。

2 結 果

2.1 腦梗死體積及神經功能損傷評分結果 Sham組未出現梗死灶；與Sham組相比，MCAO組及TAL組出現不同程度梗死灶(P<0.05)；與MCAO組相比，TAL0 h、TAL1 h、TAL3 h及TAL5 h組腦梗死體積可見明顯減降低(P<0.05)。TAL5 h組較TAL0 h、TAL1 h、TAL3 h給藥組大鼠腦梗死體積增大(P<0.05)。在TAL組中、TAL0 h、TAL1 h、TAL3 h、TAL5 h時間點的神經功能損傷評分均好于MCAO組(P均<0.05，見表1)。

2.2 實驗各組大鼠海馬CA1區神經元形態變化 大鼠海馬CA1區，采用HE染色進行觀察神經元變化，Sham組神經元形態無明顯變化，整齊排列，分布致密，細胞核圓形或橢圓形，細胞質透明，核仁清晰可見；而在MCAO組中，大鼠CA1區神經元出現皺縮，變性變化且排列紊亂，組織間出現明顯水腫，胞核出現固縮變化，呈現壞死變化。在TAL組中，大鼠海馬CA1區神經元與MCAO組相比，神經元變性壞死的數量減少，組織水腫及神經元形態變化減輕(見圖1)。

2.3 實驗各組大鼠缺血半暗區caspase-3的表達結果 根據免疫組化結果，在Sham組中可見極少量的細胞caspase-3表達為陽性(2.00±0.71)，在MCAO組中(80.40±3.85)，在TAL組給藥的各個時間點中caspase-3表達為陽性的細胞出現明顯增多。而TAL組各個給藥時間點中細胞caspase-3表達為陽性數量均較MCAO組明顯下降(P<0.05),并且TAL5 h給藥組中(59.80±4.15)與 TAL0 h組(24.60±4.39)、TAL1 h組(32.60±3.36)及TAL3 h組(45.00±6.08)相比，表達caspase-3陽性細胞數出現增加(見表2、圖2)。

2.4 實驗各組大鼠腦皮質區神經元存活數量情況 本實驗利用NeuN免疫組織化學的方法標記皮質區神經元的細胞核。根據免疫組化結果，Sham組中大鼠腦皮質含有大量存活的神經元且排列緊密(447.40±13.52)，與Sham組相比，MCAO組 (154.00±10.93)梗死皮質區存活的神經元數量明顯降低(P<0.05)，而在TAL組各個給藥時間點大鼠腦皮質存活的神經元均較MCAO組明顯增高(P<0.05)，且在TAL0 h組(3268.60±11.39)、TAL1 h組(245.60±11.18)及TAL3 h組(219.40±11.91)中尤為明顯(見表2、圖3)。

表1 各組大鼠Longa 評分、腦梗死體積的比較

與Sham組相比△P<0.05；與MCAO組相比*P<0.05；與TAL5 h組相比#P<0.05

表2 各組大鼠腦缺血半暗區caspase-3陽性細胞和腦梗死皮質神經元數量

與Sham組相比△P<0.05；與MCAO組相比*P<0.05；與TAL5h組相比#P<0.05

3 討 論

興奮性神經遞質Glu受體[12～14]包括代謝型及離子型受體兩大類，離子型受體有3個亞型：AMPA受體(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionicacid-receptors)、NMDA(N-methyl-D-aspartate receptors)以及KA(kainate receptors,KA)受體。其中AMPA受體屬于化學-門控性離子通道受體，它由GLUR1、GLUR2、GLUR3和GLUR4 4個亞基組成，在哺乳動物中樞神經系統中廣泛存在，研究發現，AMPA受體主要介導快速興奮性突觸傳遞，誘發突出后電位(excitatory-postsynaptic potential，EPSP)，而AMPA受體的激活不僅可引起長時程抑制(long term depression,LTD)，而且可解除Mg+對神經遞質與NMDA受體結合的阻礙而引起Ca2+內流增加，觸發Ca2+依賴的蛋白激酶先關第二信使，使膜性質發生變化，引起長時程增強效應(long-term potentiation，LTP)的產生，引起一系列細胞病理生理變化，這對神經元的整合及可塑性有很重要的影響，其結構與功能的穩定性對學習、認知及記憶等方面具有重要的作用。

同時研究還發現[15,16]，阻斷谷氨酸受體能夠顯著降低或者抑制癲癇樣活動的發生，從而減少癲癇樣放電的持續時間，相比于阻斷NMDA受體，這種效果在阻斷AMPA受體后更為顯著，大量基礎實驗與臨床研究已經證實[17]，AMPA受體在癲癇的同步發病過程中起到重要的作用，在各種動物模型及體外研究中，都表明AMPA受體可以作為潛在的神經保護作用點，目前其已經成為治療癲癇發病的重要靶點。由于缺血再灌注腦損傷和癲癇發作密切相關,近年來，一些研究者推測，抗癲癇藥物對缺血再灌注腦損傷同樣是有效的。本次實驗結果顯示，非競爭性AMPA受體拮抗劑他侖帕奈能夠減輕大鼠神經功能損傷，減小腦梗死體積，抑制細胞凋亡，大鼠腦梗死皮質區存活神經元數量增加，從不同角度反映了他侖帕奈確實對缺血再灌注腦損傷后具有神經保護作用，并且在缺血再灌注后前5 h給藥治療效果最佳。

那么這種新型的AMPA非競爭性受體拮抗劑在治療缺血再灌注損傷具體的機制是什么？許多學者認為，如果能夠干預興奮性神經毒性過程、抑制興奮性級聯反應，可能為缺血再灌注腦損傷治療提供新的思路。在腦部局部供血中斷，局部血流急劇下降，能量供應障礙，ATP合成大量減少,Na+-K+-ATP酶活性降低，大量興奮性神經遞質谷氨酸大量釋放，同時再攝取及滅活障礙，使谷氨酸在細胞間質大量積聚，AMPA受體過度激活，而且過度興奮AMPA受體對Na+通透性增高，細胞膜電位發生變化，使Ca+、Cl-順著電位差大量內流，引起細胞水腫，大量自由基生成，引起神經元急性期及遲發性損傷甚至死亡[18]。那么他侖帕奈則以AMPA受體為靶點，使神經元的興奮性降低，減輕由谷氨酸介導的神經元損傷，這可能是他侖帕奈挽救梗死皮質區存活神經元的主要機制之一。其次，許多實驗已經證明[19]，他侖帕奈主要作用于AMPA受體亞基家族中(GluR1～4 )GluR2亞單位，其中GluR2決定該受體是否對Ca+具有通透性，其他3種亞單位單獨或共同存在構成的AMPA受體對Ca+具有通透作用，而當GluR2存在與其它亞單位共同構成受體結構時，那么AMPA受體對Ca+的通透性減低，并具有外向整流的作用，從而穩定細胞膜電位的穩定性，減少細胞膜去極化作用，而當GluR2這一亞單位缺乏時，則會增加Ca+的通透性，引起鈣超載、自由基大量生成、細胞凋亡等一系列病理生理過程。在分子水平，同樣能夠反映GluR2亞基變化。

近年來，一些動物研究發現[20,21]，在急性缺血再灌注損傷24 h后，位于缺血再灌注損傷區特別是大鼠海馬CA1區GluR2mRNA表達水平明顯降低，而GluR1、GluR3的mRNA表達水平卻增加，細胞膜對Ca+的通透性增加，引起細胞水腫壞死，同時研究還發現，若增加AMPA受體各亞基的穩定性，阻止各亞基被修飾或調整，那么神經元損傷程度將降低。在AMPA受體4個亞基中，GluR2相比與其它3個亞基在急性缺血損傷后穩定性最差，而非競爭性AMPA受體拮抗劑他侖帕奈對GluR2的親和力最強，能夠阻止其在缺血再灌注損傷后被修飾或丟失，從而增加GluR2亞基的穩定性，能使Ca+的通透性降低，減少對神經元的損害。同時另外一些研究已經證明[22]，非競爭性AMPA受體拮抗劑相比與傳統的競爭性受體拮抗劑對神經元缺血再灌注損傷具有更好的優勢：一方面，其水溶性更高，且能更易通過血腦屏障，對急性缺血再灌注損傷的神經元保護更為有利；另一方面，其不需要與興奮性氨基酸形成競爭關系，從而阻斷急性缺血再灌注時高濃度的谷氨酸對神經元的損傷作用。

本次實驗結果顯示，他侖帕奈能夠減少caspase-3(半胱氨酸蛋白酶-3)的表達水平，減少細胞的凋亡，增加梗死周圍區神經元的存活數量，對神經元缺血再灌注腦損傷有很好的保護作用，而這與他侖帕奈抑制神經元的病態興奮性密切相關。

根據上述：非競爭性AMPA受體拮抗劑他侖帕奈對缺血再灌注腦損傷具有很好的保護作用，可能與他侖帕奈阻止急性缺血缺氧時高濃度的谷氨酸對AMPA受體的過度激活、抑制神經元的病態興奮性、阻止神經元的進一步損傷、減少細胞凋亡、增加缺血半暗區神經元的存活數量等有關。而且本次實驗顯示他侖帕奈的治療作用呈現一定的時間依賴性，隨著時間延長，神經保護作用則會減弱。

圖1 各組大鼠海馬CA1區神經元形態變化(HE×400)

圖2 各組大鼠缺血半影區caspase-3陽性細胞表達情況(免疫組化×400)

A:Sham組;B:MCAO組;C:TAL0 h;D:TAL1 h組;E:TAL3 h組;F:TAL5 h組

圖3 實驗各組大鼠梗死皮質區存活的神經元數量 (免疫組化×200)