二倍體栽培馬鈴薯高效遺傳轉化體系的建立

葉明旺，張春芝，黃三文,

（1云南師范大學生命科學學院/馬鈴薯科學研究院，昆明 650500；2中國農業科學院深圳農業基因組研究所，廣東深圳 518120）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是世界上最重要的塊莖類糧食作物，在解決全球糧食危機方面發揮著重要的作用。栽培馬鈴薯主要為同源四倍體，但四倍體遺傳的復雜性和薯塊繁殖的缺陷制約了馬鈴薯的遺傳改良。因此，越來越多的科學家呼吁進行馬鈴薯的再馴化，在二倍體水平將馬鈴薯馴化成種子繁殖的作物[1-3]。在自然界中，二倍體馬鈴薯資源是非常豐富的。馬鈴薯包含228個野生種和7個栽培種，其中70%的野生種和4個栽培種為二倍體（Solanum ajanhuiri、S. phureja、S.stenotomumsubsp.stenotomum和S. stenotomumsubsp.goniocalyx）[4]。這些二倍體原始栽培種在品質和抗性方面具有很多優異的等位基因。近年來，不同馬鈴薯基因組的公布及變異組研究為挖掘這些二倍體栽培種中蘊含的優良等位基因提供了基因組學基礎[5-9]。為了克隆二倍體栽培種中的優良等位基因并將其應用于精準育種，有必要建立高效的二倍體馬鈴薯遺傳轉化體系?！厩叭搜芯窟M展】四倍體馬鈴薯的再生和遺傳轉化體系比較成熟。早在1983年，OOMS等[10]就成功建立了四倍體馬鈴薯品種“Maris Bard”的遺傳轉化體系。隨后的幾十年間，四倍體馬鈴薯的遺傳轉化體系被不斷優化[11-14]，已經廣泛應用到馬鈴薯重要基因的功能研究中[15-17]。另外，通過遺傳轉化對四倍體馬鈴薯進行品質和抗病性的改良也取得了很大的進展[18-19]。目前，辛普勞公司已經推出了第二代轉基因馬鈴薯Innate 2，通過轉基因技術對4個性狀進行了改良：提高了晚疫病抗性、降低了褐化程度、減少了低溫儲藏過程中產生的還原糖含量以及油炸后丙烯酰胺含量（http://www.simplot.com/）。隨著基因組編輯技術的快速發展，利用基因組編輯改良四倍體馬鈴薯的品質也取得了一系列進展[20-22]?！颈狙芯壳腥朦c】相比之下，二倍體馬鈴薯遺傳轉化的研究較少，僅有少數基因型進行了遺傳轉化體系的摸索[23-25]。【擬解決的關鍵問題】本研究通過篩選預處理培養時間、誘導再生的激素比例、抗生素濃度等，建立二倍體原始栽培種的遺傳轉化體系。利用篩選出的最佳體系對其他基因型進行測試，分析不同基因型對轉化效率的影響，并分析再生植株的染色體加倍情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與培養條件

試驗所用的二倍體馬鈴薯原始栽培種均由國際馬鈴薯中心（International Potato Center，CIP）提供（表1）。所有的組培苗均于2016年7月于中國農業科學院蔬菜花卉研究所功能基因課題組組培間培養。采用MS 培養基（4.43 g·L-1MS 粉末、30 g·L-1蔗糖和 7 g·L-1瓊脂，pH=5.8）進行培養。培養條件為溫度（19±1）℃，光照強度為2 000—3 000 lx，16 h光照，8 h黑暗。

所用根癌農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）菌株為EHA 105，內含將pKSE401用EcoRⅠ單酶切插入35S-GFP-Terminal片段的pKSE402質粒（pKSE401質粒由中國農業大學陳其軍教授提供），pKSE402質粒上主要攜帶了GFP和卡那霉素抗性基因。

表1 試驗所用的二倍體馬鈴薯材料Table 1 The diploid potato clones used in this study

表2 遺傳轉化所用培養基配方Table 2 Mediums used genetic transformation

1.2 菌液的制備

挑取含pKSE402質粒的單個農桿菌菌落，接種于含有50 mg·L-1利福平和50 mg·L-1卡那霉素的液體LB培養基中，置于搖床28℃，220 r/min，黑暗條件下，過夜培養至對數生長期。將農桿菌收集到50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min。棄上清，用液體MS培養基（含40 mg·L-1乙酰丁香酮）（表2）進行重懸，OD600值調整到0.6，用于后續浸染。

1.3 預培養

取苗齡為4周的無菌苗，切取不帶腋芽的莖段，置于A1培養基中進行預培養（表2），預培養時間設置為0、1、2、3和4 d，光照條件同上。每個預培養處理120個外植體，共600個外植體。

1.4 菌液浸染與共培養

將經過預培養的莖段收集，在提前備好的農桿菌菌液中浸泡10 min，期間搖晃幾次，使農桿菌與莖段充分接觸，浸染結束后，用漏勺把菌液瀝干，之后將外植體置于三層濾紙上吸干菌液。吸干農桿菌菌液后把外植體轉入覆蓋了一張無菌濾紙的 A2培養基（表2）中于黑暗條件下共培養2 d，培養溫度為28℃。

1.5 外植體愈傷誘導培養基的篩選

將經過共培養莖段分別置于CIM1、CIM2、SIM1和SIM2中進行培養（表2），2周換一次培養基。培養4周后，CIM1和CIM2都均勻更換為SIM1和SIM2，而最初在SIM1和SIM2上培養的維持不變。每個處理200個外植體，共800個外植體。

1.6 誘導愈傷和分化的抗生素篩選

將共培養2 d的外植體置于含有不同濃度卡那霉素（0、50、75、100 和 150 mg·L-1）的 SIM2 上誘導愈傷，2周更換一次培養基直至出芽。每個處理 100個外植體，共500個外植體。

1.7 生根培養時抗生素濃度的篩選

取未轉化的帶腋芽的外植體扦插至含有不同濃度卡那霉素（0、50、75、100和150 mg·L-1）的RIM上進行生根處理。每個處理3瓶，每瓶8株。

1.8 篩選適宜遺傳轉化的基因型

利用篩選好的條件：預培養 2 d和添加了 100 mg·L-1Kan的篩選再生培養基 CIM1+SIM1、CIM1+SIM2、CIM2+SIM1、CIM2+SIM2、SIM1+SIM1以及SIM2+SIM2對其余17份二倍體馬鈴薯進行遺傳轉化，每組處理100個外植體，共600個外植體。

1.9 生根培養

待獲得的再生芽長至1—2 cm時，將再生芽切下，扦插至RIM（50 mg·L-1卡那霉素）上進行生根培養。

1.10 轉基因植株的PCR檢測和倍性檢測

設計包含綠色熒光蛋白的外源片段的擴增引物對再生植株進行擴增（引物為F：5′-AAAAGGCCCCTG GGAATCTG-3′和 R：5′-AATTGAACGCCGAAGAA CAG-3′），擴增條帶大小為320 bp。PCR體系為10 ng模板 cDNA、10 μL 2×GoTaq Colorless Master Mix 和正反向引物各 0.4 μL（10 μmol·L-1），ddH2O 補充至20 μL。反應程序為 94℃ 4 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，35次循環；72℃ 1 min，4℃保存。

參照施春暉等[26]方法，利用北京大學鳳凰工程高通量流式平臺 BD Fortessa流式細胞儀檢測陽性植株倍性樣品。

2 結果

2.1 預培養時間的確定

為了確定最佳的預培養時間，設置 5個預培養時間梯度0、1、2、3和4 d。不同預培養時間處理的外植體經過同樣的浸染和共培養之后，通過體視熒光顯微鏡進行熒光采集和統計。當預培養時間在2 d以下時，莖段傷口處熒光團面積會隨著預培養時間顯著增加，但是隨著預培養時間的進一步增加，浸染效率開始減小，直至第4天，只有少數幾個外植體上出現熒光小點（表 3）。因此確定最佳的預培養時間為2 d。

表3 預培養時間對轉化的影響Table 3 The effects of pre-culture time on transformation

2.2 不同激素配比對誘導愈傷組織和再生的影響

外植體經過2 d的預培養后用菌液進行浸染，共培養2 d后，將外植體分別轉移到CIM1、CIM2、SIM1和SIM2中進行培養。培養4周后，觀察愈傷組織的狀態，SIM2誘導愈傷組織的效率最高，且愈傷組織比較致密，呈深綠色，另外3種培養基誘導的愈傷組織較松散，呈淺綠色（表 4）。之后把 CIM1和 CIM2上的外植體均勻更換至SIM1和SIM2，進行誘芽處理，SIM1和SIM2上的外植體維持原激素比例不變，每2周換一次培養基直至出芽，統計不同激素組合的再生情況（表5）。其中，SIM2+SIM2組合誘導再生芽的能力較強，有些外植體上有多個再生芽，因此，確定SIM2+SIM2為誘導二倍體馬鈴薯材料CIP 703541的最佳激素配比。

2.3 不同抗生素濃度對再生和生根的影響

利用篩選出來的最佳培養基組合SIM2+SIM2，對愈傷誘導和芽再生階段的抗生素濃度進行篩選。外植體通過2 d預培養，經浸染和共培養后轉移至含有不同卡那霉素濃度的SIM2培養基上，8周后進行對再生芽的數目進行統計（表6）。當卡那霉素濃度在100 mg·L-1以下時，對馬鈴薯的出芽影響并不是很明顯。而當卡那霉素濃度為100 mg·L-1的時候，部分外植體的出芽明顯被抑制，而且能夠出芽的外植體以單芽為主。當卡那霉素濃度達到150 mg·L-1時，外植體經一段時間的培養后，基本趨于死亡狀態，沒有獲得再生芽。因此，選擇濃度為100 mg·L-1的卡那霉素作為篩選二倍體馬鈴薯材料CIP 703541遺傳轉化的最適濃度。

野生型馬鈴薯帶腋芽的莖段扦插在添加了不同濃度卡那霉素的RIM培養基中進行生根試驗，在卡那霉素達到 50 mg·L-1時，所有的馬鈴薯植株已經不能生根。因此，采用50 mg·L-1作為CIP 703541生根階段的卡那霉素篩選濃度。

表4 不同激素配比對莖段的愈傷組織誘導情況Table 4 Effects of different hormone ratios on callus induction

表5 不同激素配比對愈傷組織分化的影響Table 5 Effects of different hormone ratios on callus regeneration

表6 不同卡那霉素濃度對再生的影響Table 6 Effects of different kanamycin concentrations on regeneration

2.4 其他二倍體馬鈴薯材料的遺傳轉化體系的篩選

根據建立的二倍體馬鈴薯遺傳轉化體系的篩選流程，通過對另外17份二倍體原始栽培種進行同樣的遺傳轉化篩選試驗。其中，有 3份材料（CIP702961、CIP 703308和CIP 703312）能夠對設置的激素組合作出響應，但是最適的激素組合不同（表 7）。其中，CIP 703308和CIP 703312誘導再生芽效率較高，分別為45%和40%。

2.5 轉基因陽性植株的鑒定

通過不用的激素組合篩選，獲得3份再生率較高的二倍體原始栽培種（CIP 703308、CIP 703312和 CIP 703541），根據每份材料最適的激素組合分別進行大規模的遺傳轉化，轉化的外植體數分別為1 600、1 300和1 800個。將獲得的再生芽在卡那霉素濃度為50 mg·L-1的生根培養基上進行了兩輪生根測試（圖1-a和圖1-b），每一輪生根測試均淘汰一批不能正常生根的再生苗，最終分別獲得44、55和96株抗篩陽性植株，轉化效率分別為2.8%、4.2%和5.3%。經PCR檢測，所有植株均含有外源載體序列。同時利用體視熒光顯微鏡對陽性植株的 GFP熒光進行觀察，未轉化的植株由于葉綠體自發熒光呈現紅色，而陽性植株的葉片呈現紅綠相間的顏色，表皮毛的綠色比較明顯（圖1-c和圖1-d）。但是由于GFP在不同株系的表達情況不同，很難通過GFP的顏色準確判斷是否是陽性植株，因此，以是否能夠經過兩輪生根測試作為判斷陽性植株的標準。

表7 另外17份二倍體馬鈴薯原始栽培種的遺傳轉化體系篩選Table 7 Screening of optimal genetic transformation system for another 17 diploid landraces

圖1 轉基因陽性植株的檢測Fig. 1 Assays of the positive regenerated seedlings

2.6 轉基因陽性植株的倍性鑒定

馬鈴薯在經過遺傳轉化之后容易發生染色體加倍的現象。從轉化率較高的3份材料中（CIP 703308、CIP 703312和CIP 703541），分別選擇部分陽性轉化株進行染色體倍性的檢測。結果顯示，大多數陽性植株為四倍體，其中CIP 703541的陽性植株中二倍體植株的比例最高，為38.46%（表8）。

表8 陽性植株的倍性檢測Table 8 Ploidy of positive transformants

3 討論

馬鈴薯的再生和遺傳轉化效率受基因型的影響較大。HEERES等[27]對 16份四倍體材料進行了遺傳轉化，發現不同基因型對激素的響應不同，誘導再生芽的效率差異也比較大。本研究利用6個激素組合對18份二倍體原始栽培種進行了篩選，也獲得相同的結論。不同二倍體基因型的再生能力差異很大，而且再生能力強的基因型所響應的激素組合也不同。本研究獲得3份再生和遺傳轉化效率較高的二倍體資源。但是，其余大部分二倍體材料對6種激素組合均不響應，因此，有必要對更多的二倍體基因型進行激素配方篩選，然后通過全基因組關聯分析或者構建分離群體的方法挖掘馬鈴薯中控制再生的遺傳位點，將有效解決基因型對再生和遺傳轉化的影響。

無性系變異是植物組織培養中的一個常見現象[28-29]，它能在離體培養的細胞、愈傷或組織中發生，從而引起再生植株遺傳或者表觀遺傳的變異。本研究發現二倍體馬鈴薯經遺傳轉化得到的再生苗里面染色體加倍的情況比較嚴重。在檢測的3份材料里，四倍體的概率均高于二倍體，其中CIP 703308的陽性轉化株中二倍體的概率僅為 5.26%。這意味著需要進行大規模的遺傳轉化才能得到一定數目的二倍體陽性株。因此，在今后的研究中有必要篩選染色體加倍比例較低的二倍體。

二倍體馬鈴薯原始栽培種在南美洲已經經歷了幾千年的馴化和改良，除了在外觀、產量和適應性方面與現在的四倍體栽培種還存在一些差距，其他很多性狀已經接近現在的四倍體栽培種，因此，這些資源可以作為二倍體馬鈴薯育種的原始材料。通過對外觀、產量和適應性等性狀進行遺傳分析，挖掘控制這些性狀的遺傳位點，可以對二倍體原始栽培種進行定向改良。本研究建立的高效轉化體系將為驗證重要基因的功能以及利用生物技術對二倍體原始栽培種進行遺傳改良提供有力工具。

4 結論

通過對 18份二倍體馬鈴薯栽培種進行了遺傳轉化體系的摸索，成功建立了其中3份材料的高效遺傳轉化體系。證實了二倍體馬鈴薯的再生能力和遺傳轉化效率也受基因型的較大影響，此外其再生植株很容易發生染色體加倍的情況。