大豆孢囊線蟲擴展蛋白新基因（Hg-exp-1、Hg-exp-2）的鑒定及功能分析

張瀛東，孔詳超,，黃文坤，孔令安，李紅梅，彭煥，彭德良

（1中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；2南京農業大學植物保護學院， 南京210095）

0 引言

【研究意義】大豆孢囊線蟲病是由大豆孢囊線蟲（soybean cyst nematode，Heterodera glycines）引起的一種大豆生產的毀滅性病害，該病害分布范圍大、寄主范圍廣、傳播途徑多，造成經濟損失嚴重，是一種公認的極難防治的大豆病害[1]。該病害在大豆主產國如中國、美國、加拿大、巴西、俄羅斯等均有發生分布，給全球大豆生產造成重大的經濟損失。在中國一般造成大豆減產5%—10%，嚴重地塊減產30%—50%，甚至絕收[2]。孢囊線蟲在寄生過程中，食道腺細胞分泌一系列的效應蛋白，并通過口針注入到植物體內，在侵入、取食位點的建立與維持過程中發揮著關鍵作用[3-4]。細胞壁擴展蛋白 expansin是植物寄生線蟲食道腺的一種重要分泌蛋白，它通過對植物細胞壁進行修飾來降解和松弛植物細胞壁以利于線蟲侵入和遷移。通過克隆大豆孢囊線蟲擴展蛋白，明確其結構、組織定位、發育表達特性和生物學功能，可為進一步明確大豆孢囊線蟲的寄生和致病機制打下基礎，對大豆孢囊線蟲綠色可持續防控具有重要意義。【前人研究進展】植物寄生線蟲expansin能夠促使細胞的伸展和細胞壁的降解，利于線蟲的侵入，而植物寄生線蟲侵染植株首先要穿透細胞壁才能取食，無論是植物寄生線蟲本身分泌還是誘導植物合成，expansin在線蟲的整個侵染過程中都起到了關鍵的作用。馬鈴薯金線蟲（Globodera rostochiensis）的GrExpb1是第一個從植物寄生線蟲中克隆得到的expansin基因。QIN等[5]利用cDNA克隆技術，獲得了編碼細胞壁擴展蛋白的基因Grexpb1，來自 expansin多基因家族。Gr-EXPB1與植物expansin具有同源性，并且在體外實驗中對植物細胞壁延長具有誘導活性；KIKUCHI[6]從松材線蟲（Bursaphelenchus xylophilus）和擬松材線蟲（B.mucronatus）中分別克隆到了編碼expansin-like蛋白的基因，并且證實在這兩種線蟲的不同種群中均存在expansin基因。由于在非致病的擬松材線蟲中存在expansin-like蛋白，認為expansin-like蛋白只在線蟲穿行于植物組織過程中起到一定作用，而不是在致病力方面起到作用；HAEGEMAN[7]從非洲莖線蟲（Ditylenchus africanus）中克隆出一個編碼expansin-like蛋白的基因；PENG等[8]從馬鈴薯腐爛莖線蟲（D. destructor）中克隆出兩個expansin蛋白基因，通過結構域和內含子分析，推測兩個 expansin可能來源于細菌的水平基因轉移，并且具有不同的祖先來源；LIU等[9]從小麥禾谷包囊線蟲中分離出一個expansin蛋白HaEXPB2，并證實其能夠引起細胞凋亡，該蛋白定位于細胞壁，具有明顯纖維素結合活性；原位雜交顯示HaEXPB2在2齡幼蟲的食道腺合成，在侵染后的2齡幼蟲表達量最高，體外RNAi可以使2齡幼蟲的侵染率下降53%；ALI等[10]證明了馬鈴薯金線蟲expansin蛋白GrEXPB2能夠抑制植物的防御反應以及NB-LRR信號在細胞質中的誘導作用，GrEXPB2特定的序列可以誘發馬鈴薯和番茄的防御反應。在已報道的南方根結線蟲（Meloidogyne incognita）、北方根結線蟲（M. hapla）、馬鈴薯孢囊線蟲（Globodera pallida）和松材線蟲等植物寄生線蟲基因組中分別發現了20、6、7、8個expansin基因[11-15]?！颈狙芯壳腥朦c】盡管大豆孢囊線蟲的效應蛋白最先被研究，但是對于大豆孢囊線蟲擴展蛋白基因的克隆和功能尚未見報道?！緮M解決的關鍵問題】通過同源克隆和RACE技術獲得兩個大豆孢囊線蟲expansin基因的cDNA全長，構建系統進化樹，明確其在基因組中的拷貝數、在線蟲體內的表達位點和表達時間，并通過RNA干擾對該基因的功能進行研究，為大豆孢囊線蟲致病機理的解析及制定相應的防治策略打下基礎。

1 材料與方法

試驗于 2014—2017年在中國農業科學院植物保護研究所植物病蟲害生物學國家重點實驗室完成。

1.1 供試線蟲

大豆孢囊線蟲4號生理小種采自中國農業科學院植物保護研究所廊坊實驗基地，在中國農業科學院植物保護研究所溫室擴繁。采用蔗糖離心法將成熟的孢囊從土壤中分離后，滅菌水洗滌后置于3 mmol·L-1的氯化鋅溶液中，25℃孵化。收集孵化的大豆孢囊線蟲2齡幼蟲經過滅菌水洗滌，離心后，液氮速凍，-80℃低溫保存備用。

1.2 試劑

Trizol試劑、SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System、5′ RACE System for Rapid amplification of cDNA Ends Version2.0、GeneRacerTMKit購于美國Invitrogen公司；DNeasy Blood & Tissue Kit購于德國QiaGen公司；大腸桿菌感受態細胞DH5α、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于天根生化科技有限公司；EX Taq酶、3′-Full RACE Core Set Ver 2.0試劑盒、pMD18-T easy Vector等購于大連TaKaRa公司；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I、PCR DIG Probe Synthesis Kit、蛋白酶K和雜交尼龍膜購于德國Roche公司；章魚胺、明膠、亞精胺購于美國Sigma公司；異硫氰酸熒光素（FITC）購于生工生化（上海）有限責任公司；MEGAscript High Yield Transcription Kit和MEGAclearTMKit購于美國ABI公司，其他試劑購于美國Sigma公司或國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 基因組DNA、總RNA提取與第一鏈cDNA合成大豆孢囊線蟲基因組 DNA參照 QiaGen公司的DNeasy Blood & Tissue Kit基因組純化試劑盒說明書提?。豢俁NA提取采用Trizol試劑參考彭煥等[16]凍融法進行，第一鏈cDNA和擴增3′和5′末端的cDNA參照SuperScriptTMⅢ First-Strand Synthesis System和GeneRacerTMRACE Kit試劑盒說明書合成。

1.3.2 大豆孢囊線蟲expansin基因EST片段的克隆根據已報道的線蟲expansin基因的保守序列設計上下游簡并引物EXP1和EXP2（表1），以大豆孢囊線蟲cDNA第一鏈為模板進行PCR反應，反應體系：2.5 μL 10×PCR Buffer，2 μL dNTP Mixture（2.5 mmol·L-1），1 μL 引物 EXP1 和 EXP2，0.5 μL Ex Taq DNA 聚合酶，2 μL第一鏈cDNA模板，雙蒸水補齊25 μL體系。PCR反應條件為94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃/57℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環；72℃延伸10 min，PCR產物電泳分離、回收、連接并送樣測序。

1.3.3 expansin基因全長克隆 根據EST擴增序列分別設計3′ RACE特異性引物EXPB1-1、EXPB1-2、EXPB2-1、EXPB2-2 和 5′RACE 特異性引物 EXPB1-3、EXPB1-4、EXPB2-3、EXPB2-4（表 1），以大豆孢囊線蟲cDNA第一鏈為模板，參考3′-Full RACE Core Set Ver 2.0試劑盒和 5′ RACE System for Rapid amplification of cDNA Ends Version2.0，GeneRacerTMKit說明書分別進行3′ RACE和5′ RACE擴增。擴增產物經1%瓊脂糖電泳檢測、回收、連接并送樣測序。測序拼接后，設計兩組特異性引物 HgEXP1F1和HgEXP1R1、HgEXP2F1和HgEXP2R1（表1），以第一鏈cDNA為模板進行cDNA全長擴增驗證，以基因組DNA為模板進行擴增，進行基因組全長擴展，PCR擴增產物進行回收測序。

1.3.4 序列分析 序列采用DNAstar 7.1和DNAman軟件對 cDNA進行拼接和比對；使用 CLC sequence viewer 6進行開放閱讀框查找、蛋白質翻譯和序列比對；使用 EBI在線軟件 SignalP 3.0 Server[17]和TMHMM 軟件進行預測蛋白質前體信號肽和跨膜結構域預測；使用pI/Mw tool在線工具預測蛋白質分子量和等電點；使用GSDS在線軟件進行基因組結構分析；使用PHYML[18]軟件和MEGA5.0[19]軟件最大似然法（maximum likelihood，ML）進行系統進化樹構建。

1.3.5 Southern雜交 根據Hg-exp-1cDNA序列設計探針引物exp1-tz-F和exp1-tz-R（表1），以cDNA第一鏈為模板進行擴增，回收產物，回收產物采用DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ試劑盒進行探針標記。約 5 μg大豆孢囊線蟲基因組DNA被EcoRⅤ和Hind Ⅲ限制性內切酶切完全后，經過0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離，DNA片段轉膜、固定并與DIG標記的探針進行雜交，雜交過程參照DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ進行，洗脫和顯色后，觀察照相。

1.3.6 原位雜交 原位雜交過程參考DE BOER等[20]的方法進行。根據expansin基因序列，設計探針引物exp1-tz-F、exp1-tz-R、exp2-tz-F和exp2-tz-R（表1），采用PCR DIG Probe Synthesis Kit進行探針標記合成。新孵化的大豆孢囊線蟲 2齡幼蟲 4%多聚甲醛固定后用手術刀將蟲體切斷，使用蛋白酶K、甲醇和丙酮對蟲體進行消化和通透，蟲體用雜交液重懸，加入DIG標記的探針，參考DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ說明書進行雜交和洗脫。經過黑暗顯色16 h后，使用0.05%吐溫20溶液停止顯色，無菌水重懸線蟲，在Leica DM2500顯微鏡下觀察照相。

1.3.7 發育表達分析 參考 ELLING等[21]方法，略作改進，分離侵染后的2—4齡幼蟲和白雌蟲，在接種40 d后分離孢囊，收集新孵化的2齡幼蟲和卵。參照Dynbeads? mRNA DIRECTTM Kit說明書，提取不同齡期大豆孢囊線蟲 mRNA，使用 SuperScriptTMⅢFirst-Strand Synthesis System試劑盒進行第一鏈cDNA合成。以exp1-tz-F和exp1-tz-R，exp2-tz-F和exp2-tz-R為引物，以不同齡期大豆孢囊線蟲cDNA為模板進行PCR擴增，特異性引物act-F和act-R擴展Actin作為內參，擴增體系同1.3.2，反應條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56/59℃ 30 s，72℃ 1 min，27 個循環；72℃ 10 min。擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上分離，EB染色照相。

1.3.8 體外RNA干擾功能 根據Hg-exp-1的cDNA全序列，設計特異引物EXP1-T7-F和EXP1-T7-R，采用 MEGAscript High Yield Transcription Kit（Ambion）和MEGAclearTM試劑盒進行dsRNA體外轉錄和純化。參考URWIN等[22]方法將5 000頭新鮮收集的大豆孢囊線蟲2齡幼蟲轉入含有M9 buffer 40 μL，亞精胺（30 mg·mL-1）20 μL，明膠（5%）2 μL，章魚胺（200 mg·mL-1）50 μL，FITC（10 mg·mL-1）5 μL，dsRNA（2 mg·mL-1）浸泡液中，25℃浸泡24 h，以gfp dsRNA和無菌水替代 dsRNA作為對照。浸泡完的線蟲去除 dsRNA和FITC后，置于顯微鏡下觀察線蟲活力及線蟲對FITC的取食程度。

收集不同處理的線蟲約100頭，提取mRNA并反轉錄合成 cDNA作為模板，以 exp1-tz-F、exp1-tz-R和actin-R、actin-F（表1）為引物進行PCR反應，反應體系與條件參照1.3.2所述，進行基因沉默檢測。不同dsRNA處理和清水處理的線蟲，按每株300頭接種大豆苗，每個處理10次重復。置于光照培養箱25℃培養。10 d后，收集大豆根系品紅染色后，在顯微鏡下統計根內線蟲數目。35 d后分離大豆根上和土壤中的雌蟲計數，結果采用SAS軟件運用鄧肯法進行顯著性分析。

2 結果

2.1 Expansin基因克隆

通過簡并引物，從大豆孢囊線蟲cDNA中克隆長度分別為351和316 bp的片段，經過blast分析比對，與馬鈴薯金線蟲的Grexpb1同源性最高。以351 bp序列為基礎，RACE擴增到長度分別為379和542 bp的3′和5′ cDNA末端，序列拼接后獲得了長度為1 047 bp的cDNA序列，命名為Hg-exp-1（GenBank登錄號：HM798586）。以長度為316 bp的EST為核心片段，擴增長度分別為352和575 bp的3′和5′ cDNA末端，序列拼接后獲得了長度為1 037 bp的cDNA序列，命名為Hg-exp-2（GenBank登錄號：HM798586）。根據兩個基因的拼接序列，設計基因特異性引物，以H.glycines的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得長度分別為900和961 bp的片段（圖1-A、1-B），比對分析發現，其與拼接序列完全一致。采用Hg-exp-1和Hg-exp-2的全長引物，以大豆孢囊線蟲2齡幼蟲基因組DNA為模板，分別擴增出全長為2 108和2 927 bp的片段（圖1-C、1-D），分析發現Hg-exp-1和Hg-exp-2基因組DNA均包含6個大小不等的內含子，Hg-exp-1最大的內含子為 791 bp，最小的為 63 bp，Hg-exp-1最大的內含子為524 bp，最小的為150 bp，所有內含子均符合GT-AG的剪接規則，6個內含子將Hg-exp-1分割為7個外顯子（圖1-E）。

表1 PCR引物序列Table 1 The PCR primer sequences

2.2 Hg-exp-1和Hg-exp-2序列分析

Hg-exp-1cDNA全長為1 047 bp，包含一個長度為867 bp 開放閱讀框（ORF），5′端和3′端非編碼區分別為38和142 bp，編碼一個長度為288個氨基酸殘基的多肽，HG-EXP-1的預測分子量為27.401 kD，等電點為 8.54，含有一個N-糖基化位點為 Asn273。Hg-exp-2cDNA全長為1 037 bp，其5′端非編碼區為97 bp，3′端非編碼區為48 bp，開放閱讀框的長度為888 bp。推測編碼的蛋白質HG-EXP-2含有295個氨基酸，預測分子量為28.010 kD，等電點為7.68。信號肽和跨膜結構域分析發現，HG-EXP-1和 HG-EXP-2分別包含一個長度為23和22個氨基酸殘基的信號肽，均無跨膜結構域，表明其為分泌型蛋白。

預測蛋白序列比對發現，HG-EXP-1（ADL29728）和HG-EXP-2（ADY02960）之間的相似性為80%。多個植物線蟲 EXP蛋白比對發現，植物線蟲擴展蛋白DPBB結構域中存在著3個在植物EXP蛋白中保守的半胱氨酸和1個HFD位點（圖2）。Blast比對分析發現，大豆孢囊線蟲HG-EXP-1序列與馬鈴薯金線蟲的GR-EXPB1（CAC83611）和GR-EXPB2（CAC84564）、非洲莖線蟲的DA-EXPB1（ADJ57307）、松材線蟲的BX-EXPB1（BAG16537）、擬松材線蟲的BM-EXPB1（BAG16534）和細胞性黏菌（Polysphondylium pallidum）的 PP-EXPB1（EFA74732）氨基酸序列相似性為22%—79%，與馬鈴薯金線蟲GR-EXPB1的相似性為66%，與松材線蟲和擬松材線蟲的expansin-like蛋白的相似性分別為23%和22%，與馬鈴薯腐爛莖線蟲和禾谷孢囊線蟲的一致性分別為44%和71%。將已報道的植物寄生線蟲擴展蛋白序列和部分其他物種相似性較高的序列采用MEGA軟件的ML方法構建系統發育樹（圖 3），結果表明大豆孢囊線蟲 HG-EXP-1和HG-EXP-2與禾谷孢囊線蟲HA-EXP-1和4個馬鈴薯孢囊線擴展蛋白（GR-EXP-1、GR-EXPB-1、GP-EXP-1和 GP-EXPB-1）聚為一分支，3個根結線蟲擴展蛋白（MH-EXP和MI-EXP）聚為一分支，馬鈴薯腐爛莖線蟲DD-EXP-1、DD-EXP-2與非洲莖線蟲Da-EXP-1聚為一分支，以上3支聚在一更大的分支，松材線蟲和擬松材線蟲的擴展蛋白（BX-EXP Like-1/2/3和BM-EXP-Like-1/2）聚為一支，爪哇根結線蟲MJ-EXPB-1單獨聚為一支。植物線蟲和細菌與真菌的擴展蛋白聚在一個大的分支中。

圖1 PCR擴增基因cDNA全長（A、B）、基因組全長（C、D）電泳結果及Hg-exp-1、Hg-exp-2內含子、外顯子分布示意圖（E）Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of PCR products, full length sequence of cDNA (A, B) and genomic DNA (C, D). Intron and exon distribution of Hg-exp-1 and Hg-exp-2 (E)

2.3 Southern雜交

以EcoRⅤ和HindⅢ兩種限制性內切酶酶切大豆孢囊線蟲基因組DNA，經過轉膜、雜交和顯色后，結果顯示，EcoRⅤ和HindⅢ限制性內切酶酶切的基因組DNA和地高辛標記的Hg-exp-1的探針雜交均出現5—6個雜交信號（圖4），表明Hg-exp-1存在于大豆孢囊基因組中，為多拷貝或多基因家族。

2.4 原位雜交

以地高辛標記標記雜交探針，原位雜交結果表明，兩個基因的負鏈探針在大豆孢囊線蟲2齡幼蟲的亞腹食道腺細胞中具有明顯的雜交信號，地高辛正鏈探針雜交均沒有觀察到雜交信號（圖 5），表明 expansin基因在大豆孢囊線蟲2齡幼蟲的亞腹食道腺細胞轉錄表達。同時還發現，兩個基因的雜交信號沒有明顯的差異。

2.5 Hg-exp-1和Hg-exp-2發育表達分析

半定量 PCR檢測結果表明，大豆孢囊線蟲Hg-exp-1和Hg-exp-2主要在線蟲的寄生前和寄生后2齡幼蟲中表達，在寄生期3齡幼蟲表達量降低，在4齡幼蟲、卵和雌蟲中不表達（圖6）生時間的不斷延長逐漸降低。

圖2 大豆孢囊線蟲細胞擴展蛋白（HG-EXP-1、HG-EXP-2）與其他線蟲細胞擴展蛋白的氨基酸序列比對Fig. 2 Alignment of amino acid sequences of H. glycines expansin proteins (HG-EXP-1, HG-EXP-2) with other expansin proteins

圖3 基于最大似然法（ML）構建的擴展蛋白進化樹Fig. 3 Unrooted phylogenetic tree of expansin proteins constructed by maximum likelihood analysis

2.6 大豆孢囊線蟲expansin基因RNA干擾功能

dsRNA 浸泡4、8、12、16和20 h后，采用半定量PCR進行Hg-exp-1轉錄水平檢測。結果表明，在去除dsRNA 12 h內，基因的表達量下降不明顯，在16 h后Hg-exp-1轉錄水平大幅度下調，到 20 h后Hg-exp-1轉錄水平達到最低。在Actin對照中，不同處理的基因轉錄無明顯變化（圖 7）。表明優化的浸泡體系成功誘導Hg-exp-1基因沉默。

經過Hg-exp-1dsRNA處理的大豆孢囊線蟲10 d后寄生到植物根部的數目比 GFP-dsRNA對照和清水對照的線蟲數目下降 38.3%（圖 8-A—D），35 d后Hg-exp-1dsRNA處理的大豆孢囊線蟲新形成的雌蟲數下降43.4%（圖8-E）。

3 討論

植物寄生線蟲侵染植株首先要透過細胞壁形成取食結構，無論是植物寄生線蟲本身分泌還是誘導植物合成，expansin在線蟲的整個侵染過程中都起到了關鍵作用，本研究從大豆孢囊線蟲中分離鑒定出兩個擴展蛋白的基因，并對其基因結構、表達部位、拷貝數和基因功能等進行了系統研究，明確了其在大豆孢囊線蟲侵染早期起著關鍵作用。

圖4 Southern雜交結果Fig. 4 The Southern blot result of expansin from H. glycines

圖5 大豆孢囊線蟲expansin 基因的組織定位Fig. 5 Tissue localization of expansin mRNA using in situ hybridization

HG-EXP-1和HG-EXP-2的氨基酸序列與馬鈴薯金線蟲GR-EXPB1的同源性最高，推測其可能具有與GR-EXPB1相似的功能，即破壞植物細胞壁的共價鍵，松馳細胞壁，從而利于線蟲侵入[5]。序列比對結果表明，DPBB結構域比較保守，具有多個植物擴展蛋白中保守存在的半胱氨酸和一個 HFD位點[23]，其中 3個半胱氨酸位點和植物擴展蛋白保守，2個在植物線蟲中保守，在植物線蟲中HFD主要表現為HVD。Blast結果表明Hg-exp-1和Hg-exp-2的氨基酸序列與植物寄生線蟲expansin序列相似性較高，最高達71%以上，而與植物來源的expansin蛋白相似度極低，證明其可能與植物expansin起源不同。

圖6 大豆孢囊線蟲expansin基因發育表達分析Fig. 6 Expression of expansin genes in developing stages of H. glycines

圖7 RNA干擾后Hg-exp-1的轉錄水平Fig. 7 The expression level of Hg-exp-1 by vitro RNAi

圖8 Hg-exp-1 dsRNA浸泡處理后的大豆孢囊線蟲侵染大豆的染色結果和侵染率檢測Fig. 8 Infection of in soybean roots with nematode following Hg-exp-1 dsRNA treatment and the number of nematodes in soybean roots

聚類分析結果表明，植物線蟲聚為一個大的分支，其中大豆孢囊線蟲expansin蛋白與其他孢囊線蟲聚為一支，根結線蟲聚為一支，松材線蟲和擬松材線蟲聚為一支。同時多個細菌和真菌的expansin蛋白也與植物線蟲的expansin蛋白聚在一個更大的分支中。植物中的EXP單獨聚為一個分支。細菌中也存在著相似的蛋白，這些基因都存在內含子和PolyA尾，表明這些基因編碼的蛋白可能是通過基因水平漂移（genehorizantol transfer，GHT）從細菌獲得的。對非洲莖線蟲和馬鈴薯腐爛莖線蟲的研究也表明在植物寄生線蟲expansin基因聚在一個單獨的大分支中，與真菌、細菌與植物分開，且植物寄生線蟲expansin基因中存在相同的內含子，位于相同的位置，由此推測植物寄生線蟲中的expansin基因可能有相同的起源[8]，據此筆者推測，包括大豆孢囊線蟲在內的植物線蟲的擴展蛋白基因可能來源于植物線蟲水平基因轉移。

發育表達分析結果表明，大豆孢囊線蟲兩個expansin基因主要在線蟲的寄生前和寄生后2齡幼蟲中大量表達，在寄生期3齡幼蟲中表達量降低，在4齡幼蟲、卵和雌蟲中不表達。總體趨勢是隨著寄生時間的不斷延長表達量逐漸降低，在禾谷孢囊線蟲研究中發現，ha-expb1和ha-expb2在侵染后2齡表達量最高[24-25]。孢囊線蟲在侵染過程中，2齡幼蟲必須通過口針的機械壓力和口針分泌物的共同作用，降解植物細胞壁，建立取食位點，才能開始侵染循環。在植物線蟲口針分泌物中，目前已經發現了一系列對細胞壁具有降解和修飾活性的效應蛋白，包括纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、擴展蛋白等。這些酶類的表達均在侵染前2齡幼蟲和侵染后2齡幼蟲最高[26-27]。一旦寄生關系建立，固著性內寄生線蟲將從固定取食細胞獲得營養，不需要再次穿刺植物細胞壁，因此表達量逐漸降低。

原位雜交結果表明，Hg-exp-1和Hg-exp-2在大豆孢囊線蟲的亞腹食道腺中大量表達，其結果和其他植物線蟲的expansin基因原位雜交結果一致[5-6,28]。序列分析發現，Hg-exp-1和Hg-exp-2編碼的氨基酸序列5′端均含有一個分泌信號肽，推測該類基因編碼的蛋白是由線蟲食道腺細胞分泌，通過線蟲口針的穿刺隨口針分泌物進入植物組織。該結果進一步證明了亞腹食道腺的分泌物主要在線蟲侵染植物降解植物細胞壁和建立取食位點過程中起作用的觀點[29-30]。

Southern雜交結果表明，大豆孢囊線蟲Hg-exp-1存在其基因組中且以多拷貝或多基因家族存在，在其他植物線蟲中均發現了擴展蛋白基因屬于多基因家族，同時基因組測序發現，南方根結線蟲、北方根結線蟲、馬鈴薯孢囊線蟲、松材線蟲等植物寄生線蟲基因組中分別發現了20、6、7、8個expansin基因[11-15]。

RNA干擾功能研究發現，大豆孢囊線蟲Hg-exp-1dsRNA處理16 h后，轉錄水平均大幅下調，在20 h后，基因轉錄水平降至最低，說明dsRNA成功導入大豆孢囊線蟲體內，介導了對應靶基因的沉默。Hg-exp-1干擾后，線蟲的入侵率和雌蟲數分別下降 38.3%和43.4%，說明Hg-exp-1在大豆孢囊線蟲侵染過程中起關鍵作用。與禾谷孢囊線蟲擴展蛋白基因HaEXPB2和細胞壁修飾基因Ha-eng-2相似，RNA干擾后線蟲的入侵率都顯著減少，而對入侵后線蟲產生孢囊沒有明顯影響[9]，對大豆孢囊線蟲其他細胞壁修飾酶的研究發現，對大豆孢囊線蟲的果膠裂解酶基因Hg-pel-6進行 RNA干擾同樣減少其對寄主的侵染率[26]，因此Hg-exp-1的功能可能是在早期通過修飾細胞壁來促進線蟲的侵染。LIU等的研究證明，禾谷孢囊線蟲和馬鈴薯金線蟲的擴展蛋白基因HaEXPB2和GrEXPB2均能誘導激活寄主植物的防御反應[9-10]，而 HG-EXP-1在作用于植物細胞壁時是否會被寄主感知并進一步激活寄主的防御反應，以及其如何修飾寄主細胞壁來促進侵染仍有待進一步研究。

4 結論

從大豆孢囊線蟲2齡幼蟲中成功鑒定出兩個長度分別為1 047和1 037 bp的擴展蛋白基因Hg-exp-1和Hg-exp-2。Hg-exp-1體外 RNA干擾后，根內線蟲 2齡幼蟲數和雌蟲數分別下降 38.3%和 43.4%，由此確認其在大豆孢囊線蟲寄生早期過程中起重要作用。