長期施用氮肥和磷肥對東北黑土叢枝菌根真菌群落組成的影響

王慶峰，姜昕，馬鳴超，關大偉，趙百鎖，魏丹，曹鳳明，李力，李俊

（1中國農業科學院農業資源與農業區劃研究所，北京100081；2農業部微生物產品質量安全風險評估實驗室，北京100081；3黑龍江省農業科學院土壤肥料與環境資源研究所，哈爾濱 150086）

0 引言

【研究意義】我國東北黑土帶是世界三大黑土帶之一，其養分豐富，有機質含量高，是我國重要商品糧生產基地，以20%的耕地生產出全國30%的糧食，對我國糧食安全起著舉足輕重的作用。由于長期不合理施肥和耕作，東北黑土農田質量日益退化，包括存在土壤酸化、土壤養分發生變化、土層變薄以及土壤微生物活性降低等一系列問題[1]。叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizae，AM）真菌是土壤中重要微生物類群之一，廣泛分布于自然界土壤中，能夠與陸地上大約 80%的植物根系形成共生關系[2]。這種共生關系的維持一方面依賴于植物提供光合產物（主要是六碳糖）供AM真菌生長和代謝[3-4]，另一方面AM真菌能夠促進植物對于土壤中營養元素的吸收（尤其是磷、氮元素），提高植物對于病原菌的抗性和抗干旱能力等[5-6]，在農業可持續發展中具有重要作用[7]。因此，開展長期施肥條件下東北黑土中AM真菌群落組成研究，能為進一步認識AM真菌對化肥的響應機制，以及改進施肥和耕作制度提供依據。【前人研究進展】研究表明長期不合理農藝措施（如長期過量不合理施肥）已經使土壤中養分含量發生顯著改變[1,8]。郝小雨等[9]研究表明，長期施肥提高了土壤中全氮、可溶性有機氮等養分含量。丁建莉等[10]研究連續施肥長達36年的我國東北黑土發現，施用化肥或有機肥等顯著提高了土壤有機質、速效磷、全氮等養分含量；養分含量變化將導致土壤中AM真菌和植物的共生關系發生改變。根據功能均衡模型理論（the functional equilibrium model），當土壤中養分含量發生改變時，植物將光合作用產生的能量物質分配給能夠給植物提供其他限制性物質的物種[11]。張旭紅等[12]研究了黑龍江海倫長期定位培肥試驗地黑土中AM真菌群落結構的變化，結果表明隨著土壤肥力的提升，AM 真菌的豐度和密度均呈增加趨勢，而當肥力提高到一定程度后土壤中AM真菌的豐度和密度開始下降。土壤中單施氮肥或磷肥能夠降低土壤中AM真菌數量、物種豐富度和多樣性[7,13-15]。另外，氮肥對 AM 真菌群落的影響受土壤中有效磷的影響，氮肥在磷缺乏時能夠提高土壤中AM真菌豐富度和多樣性，而在磷豐富時降低[16-17]。但是研究多集中在根內AM真菌，而對土壤中AM真菌的涉及較少。CESARO等[18]的研究表明，土壤中AM真菌物種多樣性和豐度高于植物根內，說明植物根內AM真菌只是土壤AM真菌的一部分。另外，研究表明土壤中微生物受土壤環境因子的影響。如本課題組以東北黑土為研究對象，發現長期施用化肥降低了黑土中細菌和真菌的多樣性，改變了土壤中細菌和真菌的群落組成，影響東北黑土微生物群落結構的主效環境因子是土壤pH[1,19]。楊海水等[20]綜述了影響AM真菌群落結構的影響因素，發現環境因子，寄主植物以及土壤類型是影響AM真菌群落結構的主要因素。【本研究切入點】近年來，在國家日益重視東北黑土地保護的背景下，人們加快了對東北黑土的研究。與我國南方酸性紅壤相比，東北黑土的酸化是由長期施用化學肥料導致的，且土壤有機質含量較高，由土壤提供的養分元素水平也較高。然而，長期施肥對肥沃的黑土中 AM 真菌群落組成的影響以及影響AM 真菌群落結構的主要因素未見報道。【擬解決的關鍵問題】本研究選取5種不同施肥處理的黑土耕層土壤為研究對象，采用Illumina Miseq測序平臺，探討長期連續施用氮肥和氮、磷混施東北黑土AM真菌多樣性和群落組成的變化及其與土壤理化性質的關系。本研究的開展有助于了解長期施肥條件下，土壤中AM真菌群落組成變化規律，為優化該地區農田施肥制度，提高土壤肥力，維護農業可持續發展等方面提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗田位于黑龍江省哈爾濱市農業部黑龍江耕地保育與農業環境科學觀測站（45°40′N，126°35′E），海拔151 m，年降水量533 mm，年平均氣溫3.5℃，屬松花江二級階地，地勢平坦，土壤類型為黑土。長期定位試驗從1980年起按小麥-大豆-玉米順序輪作，每年種植一季，到2016年為第37個生長季，小麥茬。本研究選擇5個處理：CK（不施肥處理），N1（單施常量氮肥），N1P1（混施常量氮肥和磷肥），N2（單施2倍常量氮肥），N2P2（混施2倍常量氮肥和磷肥）。各小區面積36 m2（9 m×4 m），氮、磷肥分別為尿素和重過磷酸鈣。氮、磷肥小麥和玉米季施用量為150 kg N·hm-2·a-1和 75 kg P2O5·hm-2·a-1。氮、磷肥大豆季施用量為 75 kg N·hm-2·a-1和 150 kg P2O5·hm-2·a-1。氮、磷肥均為秋施肥（玉米季氮肥50%秋施，50%于玉米大喇叭口期追施）。

1.2 樣品采集

土壤樣品采集于2016年6月29日（小麥正處于灌漿期），在無根區域采集0—20 cm的耕層土壤。每個小區隨機取10個點，充分混勻后作為該施肥處理的一個樣品，每個處理3個重復。試驗共采集15個樣品，每個樣品一部分于-80℃保存，用于分子生物學分析，一部分于室溫下風干、研磨并過2.0 mm篩，用于土壤理化性質的測定。

1.3 土壤理化指標的測定

土壤pH參照魯如坤[21]的方法（土水比1:1）測定。土壤有機質含量測定采用重鉻酸鉀容量法[22]，土壤全氮采用凱氏定氮法測定[22]，速效鉀采用乙酸銨浸提-原子吸收火焰光度法[1]，有效磷采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法[10]，硝態氮、銨態氮采用2 mol·L-1KCl浸提，然后利用流動分析儀測定。

1.4 土壤總DNA提取與高通量測序

總DNA提取采用Power Max Soil DNA Isolation Kit試劑盒（MOBIO，USA），每個樣品稱取0.25 g土壤，依照試劑盒說明書提取土壤總DNA。所提取的土壤總DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA完整性，Nano Drop測定DNA純度和濃度。15個樣品的AM真菌DNA采用巢式PCR擴增。第一對引物包括LR1（5′-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GA-3′），FLR2（5′-GTC GTT TAA AGC CAT TAC GTC-3′）[23]；第二對引物包括FLR3（5′-TTG AAA GGG AAA CGA TTG AAG T-3′），PLR4（5′-TAC GTC AAC ATC CTT AAC GAA-3′）[24]。第二對引物包括接頭 A、B和樣品識別序列。兩輪 PCR擴增體系都包括：5 μL 10×Pyrobest緩沖液，4 μL dNTPs（2.5 mmol·L-1），上下游引物各 2 μL（10 μmol·L-1），0.75 U Pyrobest DNA聚合酶和30 ng模板DNA。擴增條件參照前人研究方法[7]，兩輪擴增條件均為 98℃預變性 5 min，98℃變性45 s，58℃退火50 s，72℃延伸45 s，30個循環，72℃延伸10 min。制備Amplicon文庫后，應用Illumina MiSeq PE250平臺進行測序。

1.5 數據處理和分析

通過Illumnia Miseq平臺測序所得的下機數據經過QIIME（v1.8.0）軟件進行質量控制[7]。具體過程為：去除質量值低于 20的序列；根據序列間的重復序列（overlap）將序列進行拼接；去除引物序列，并根據GenBank數據庫檢測并去除嵌合體，獲得高質量序列。利用CROP軟件將核苷酸相似度大于97%的序列作為一個分類操作單元（OTU）[25]，利用GenBank數據庫對物種進行注釋，并去除非AM真菌序列和所有處理中只有一條序列的OTU[26]，將所有樣品序列進行抽平（Subsample）。根據不同AM真菌類群在該樣品所占的比例計算AM真菌類群相對豐度。利用Mothur軟件（V1.31.2）計算樣品α多樣性。

數據分析利用Excel 2010，SPSS 19.1和Conoco5.0軟件進行。利用單因素方差分析（ANOVA，Tukey’s test）分析不同處理間理化性質、α多樣性以及AM真菌相對豐度差異。基于Bray-Curtis相似距離，運用非度量多維度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）對東北黑土中AM真菌β多樣性進行分析。采用R（v3.1.1）軟件包中的ANOSIM分析不同處理間AM真菌群落結構的差異顯著性，并采用冗余分析（RDA）進行土壤理化性質和AM真菌群落組成的關系分析。

2 結果

2.1 長期施用氮、磷肥對土壤理化性質的影響

連續施用氮肥以及氮、磷肥混施顯著改變黑土理化性質（表 1）。與對照（不施肥）相比，長期施肥顯著降低土壤 pH（P＜0.05），且隨著氮肥施用量的增加，pH降低幅度增加，特別是施2倍常量氮肥處理（N2和N2P2），pH分別降低至5.01和4.90，降低了1.83和1.94個單位。與對照處理相比，單施氮肥處理，土壤有效磷含量變化不顯著（P＞0.05），而氮、磷混施顯著提高土壤有效磷含量。長期施用氮肥以及氮、磷肥混施顯著降低土壤速效鉀含量，提高土壤全氮、銨態氮、硝態氮和土壤有機質含量，特別是施用2倍常量氮肥處理，其全氮、銨態氮、硝態氮和土壤有機質含量顯著高于施常量氮肥處理和不施肥處理。

表1 不同施肥處理土壤理化性質Table 1 Properties of soil samples under long-term fertilizer regimes

2.2 長期施用氮、磷肥對土壤AM真菌群落組成和多樣性的影響

通過高通量測序共產生238 113條高質量序列，平均每個樣品含有15 874條，所有序列共歸為259個OTUs，其中128個OTUs是非AM真菌序列，非AM真菌的序列數僅占總序列的4.1%。所有樣品覆蓋度指數（good’s coverage value）在 97%相似度下均大于99%，說明測序深度已足夠評價該土壤AM真菌群落組成和多樣性。

在科水平上（圖1），主要AM菌包含4個科，分別為球囊霉科（Glomeraceae）（13.21%—64.53%）、Claroideoglomeraceae（2.66%—22.70%）、巨孢囊霉科（Gigasporaceae）（0.28%—29.65%）和類球囊霉科（Paraglomeraceae）（0.03%—3.47%）。ANOVA分析表明，長期施用氮肥以及氮、磷肥混施顯著改變AM 真菌群落的組成。其中，長期氮、磷添加顯著降低Glomeraceae，且其豐度在單施氮肥處理比氮、磷肥混施處理豐度低；而單施氮肥處理的 Gigasporaceae和Paraglomeraceae相對豐度比氮、磷肥混施處理高；Claroideoglomeraceae相對豐度在 N1P1處理中較高，而其他處理低于對照。在屬水平上（圖2），主要AM菌包含7個屬，其中Rhizophagus和Septoglomus在各施肥處理間沒有顯著差異（圖2-e、圖2-f），而球囊霉屬（Glomus）、近明球囊霉屬（Claroideoglomus）、巨孢囊霉屬（Gigaspora）和類球囊霉屬（Paraglomu）相對豐度在各處理間具有顯著差異。與對照處理相比，長期施肥降低了管柄囊霉屬（Funneliformis）和Septoglomus菌屬相對豐度，而提高了Paraglomu的相對豐度。同時，在氮肥基礎上添加磷肥對 AM真菌群落組成也具有顯著的影響，如Glomus和Funneliformis相對豐度在 N1P1和 N2P2處理中高于N1和N2處理；而Gigaspora和Paraglomu則表現出相反的特征。

長期施用氮肥以及氮、磷肥混施對AM真菌多樣性的影響見表2。長期單施氮肥對AM真菌多樣性指數（PD_whole_tree），豐富度指數（Chao1）以及OTUs數量影響不顯著（P＞0.05），說明長期單施氮肥對黑土中AM真菌多樣性影響不大。但是氮、磷混施（N1P1和N2P2）降低土壤中AM真菌多樣性，特別是N1P1處理顯著降低土壤中PD_whole_tree指數，

Chao1指數以及OTUs數量，其與對照相比，分別降低了16%、16%和15%（表2）。對不同氮、磷添加處理的AM真菌β多樣性分析結果如圖3所示，其中第一排序軸代表AM真菌38.54%群落組成變異，而第二排序軸代表AM真菌36.66%群落組成變異。施肥顯著改變AM真菌群落組成，其中N1和N2處理的群落組成較為接近，而 N1P1和 N2P2處理的群落結果較為接近。ANOSIM分析表明，各處理間AM真菌群落組成差異達到顯著水平（表 3），也再次證明N1和N2處理的AM群落組成較為相似，N1P1和N2P2群落結果較為接近，而對照與施肥處理之間的差異性較大。

圖1 不同施肥處理中AM真菌組成（科水平）Fig. 1 Relative average abundances of AM fungi under different fertilization (family level)

圖2 不同施肥處理中AM真菌組成（屬水平）Fig. 2 Relative average abundances of AM fungi under different fertilization (genus level)

表2 不同施肥土壤中AM真菌α多樣性Table 2 Effects of long-term fertilizer regimes on the OTUs, coverage, richness and diversity

圖3 不同施肥處理中AM真菌群落組成NMDS（OTU水平）Fig. 3 Results of NMDS analysis based on Bray-Crutis distance at OTU level

2.3 AM真菌群落組成與土壤理化性質相關性

RDA分析結果如圖 4，土壤理化性質共解釋62.94% AM真菌群落組成變化。第一排序軸解釋群落變化的 24.20%，而第二排序軸解釋群落變化的19.49%。Monte Carlo檢驗顯示，有效磷（F= 3.9，P= 0.007，解釋量為19.6%），土壤pH（F= 3.3，P= 0.007，解釋量為20.2%）對AM真菌群落組成影響最顯著。

3 討論

3.1 氮肥對土壤AM真菌多樣性的影響

本研究結果表明，長期單施氮肥沒有顯著改變土壤中AM真菌豐富度和多樣性，這可能是AM真菌對施入土壤的氮肥反應不敏感造成的[19,27]。然而，EGERTON-WARBURTON 等[16]通過蔗糖密度梯度離心分離 AM真菌孢子的研究方法發現（該方法靈敏度較低，僅能檢測到相對豐度較高物種種類），在磷缺乏的土壤中施用氮肥能夠提高土壤中 AM 真菌豐富度和多樣性，并且發現影響 AM 真菌多樣性的主要因素是相對豐度較低的物種。在本研究中，高通量測序能夠較全面檢測到土壤中物種種類，包括相對豐度較低的物種，更能準確評價土壤中AM真菌多樣性[1]。長期施用氮肥改變了土壤 AM 真菌群落結構。這可能是由于長期施肥降低了土壤中優勢菌群的豐度，如與對照相比，Glomeraceae相對豐度在 N1處理中降低了 45.3%，在N2處理中降低了 79.5%；而提高了土壤中非優勢菌群的相對豐度，如Paraglomeraceae等。因此，37年連續單施氮肥改變了土壤中AM真菌群落結構，其通過降低優勢菌群的豐度，提高非優勢菌群豐度的方式影響AM真菌多樣性，使東北黑土AM真菌α多樣性保持穩定。

圖4 不同施肥處理土壤中AM真菌和土壤理化性質冗余分析（OTU水平）Fig. 4 Redundancy analysis (RDA) between AM fungi and soil properties under different fertilization regimes (in OTU level)

表3 不同處理間AM真菌群落差異性分析Table 3 The AM fungal composition differentiation between different treatments under long-term fertilization

3.2 氮、磷混施對土壤AM真菌多樣性的影響

與 CAMENZIND等[26]研究結論一致，長期氮、磷肥混施降低土壤中 AM 真菌 α多樣性。同時還與EGERTON-WARBURTON 等[16]的研究結論一致，即在磷豐富土壤中，氮肥能夠降低土壤AM真菌多樣性。考慮到AM真菌的主要功能是促進植物對于土壤磷素的吸收[28]，土壤中磷肥的添加使AM真菌-植物共生體系利益分配發生變化，植物會減少對AM真菌物質能量的分配[29]，經過長期植物的選擇作用，某些得不到足夠能量的物種將被淘汰。然而，不同種類AM真菌的功能是相對保守的[30-31]，土壤中AM真菌多樣性降低說明土壤中AM真菌功能多樣性降低。

長期氮、磷添加改變土壤中AM真菌的群落組成。該結果和 QIN等[15]長期向土壤中添加營養元素將改變土壤中AM真菌群落組成的研究結論一致。當植物缺乏某種元素時，植物會將其光合產物分配給能夠幫助植物獲得該元素的微生物[32]。在資源減少的情況下，能夠高效獲得光合產物的AM真菌將會增多，而獲得光合產物效率低的AM真菌將會減少[33]。在本研究中，長期施用磷肥提高了土壤中有效磷的含量。Glomeraceae在 N1P1和 N2P2處理中的相對豐度比 N1和N2高。這可能是因為Glomeraceae中許多種類（包括Glomus，Funneliformis）在磷缺乏的土壤中幫助植物吸收土壤中磷的作用較低[32]，而在磷含量較高土壤中，能提高作物對于磷的吸收[34]，并且只需要從寄主中獲取少量光合產物[34-35]。另外，Funneliformis中一些物種，如Funneliformis mosseae具有較強磷耐受性，并且傾向于在有效磷含量較高土壤中生存[36]。因此，長期氮、磷肥混施提高了該AM真菌類群的生長。與Glomeraceae相反，Gigasporaceae和Paraglomeraceae相對豐度在有磷肥添加土壤中低于無磷肥添加土壤，該研究結果與 LIN等[37]研究結果相同，說明在磷豐富的土壤中，植物會減少對該AM類群的能量投入，而在磷缺乏的土壤中，植物可能加大對Gigasporaceae和Paraglomeraceae的能量供應，從而獲得更多的磷元素[31]。如Gigaspora、Paraglomu在磷缺乏土壤中可以提高植物對于磷素吸收，但是當土壤中有效磷含量提高時，植物不再需要其提供磷，尤其像小麥這種須根植物[38-39]。

由于不同種類AM真菌的功能相對保守[31]，AM真菌群落結構的改變不僅改變植物-AM 真菌物質能量交換的效率，也將影響土壤中其他生物過程。例如，Glomeraceae對于病原菌的抗性高于Gigasporaceae[40]。在本研究中，長期施肥降低了Glomeraceae的豐度，說明長期施用化肥提高植物發生病害的可能性；與氮、磷肥混施相比，長期單施氮肥降低了Glomeraceae豐度，而提高了Gigasporaceae豐度，說明長期單施氮肥使植物發生病害的可能性高于氮、磷肥混施。

3.3 AM真菌群落結構與土壤理化相關性

在陸地生態系統中，影響AM真菌群落組成和分布的主要因素是土壤 pH[41]。在本研究中，我們發現AM真菌群落組成與土壤pH具有較強的相關性（F=3.3，P= 0.007），這可能是因為土壤pH能夠直接影響AM真菌生理狀態、改變其生態位，并通過調節土壤養分的生物有效性等間接影響AM真菌群落[42]。另外，不同種類的AM真菌對土壤酸堿性的耐受不同，如Glomeraceae對酸性土壤比較敏感，長期施用氮、磷肥降低Glomeraceae的相對豐度[43]。RDA分析表明，東北黑土AM真菌除了受土壤pH的影響外，也受土壤有效磷含量的影響。研究已表明，土壤中AM真菌對土壤中磷的活化作用受土壤中有效磷的影響[7]，因此，該研究結果能夠指導我們合理施肥以及利用AM真菌提高作物產量。如Gigasporaceae和Paraglomeraceae可能在磷缺乏的土壤中對植物吸收土壤中磷發揮更大的作用[31]。。

4 結論

長期單施氮肥對AM真菌多樣性影響不大，氮、磷肥混施降低東北黑土AM真菌多樣性；土壤pH和有效磷含量是導致土壤中AM真菌群落差異的主要因素。因此，長期施用氮、磷肥引起土壤理化性質發生改變，降低氮磷利用率，導致土壤養分流失，造成環境污染，有悖于節能減排目標；改變了黑土中AM真菌群落結構組成，使土壤中原有的氮磷循環發生改變。本研究結果為認識AM真菌在長期施肥土壤中的群落組成變化提供重要的參考，并為將來利用AM真菌提高土壤養分有效性提供依據。