基于氧化石墨烯的環糊精型色譜固定相的制備及在對映體分離與親水色譜中的應用

李 強 李媛媛* 朱 楠 高柱仙 李添君 周 彤 馬玉龍

1(寧夏大學省部共建煤炭高效利用與綠色化工國家重點實驗室， 銀川 750021)2(寧夏大學化學化工學院， 銀川 750021)

1 引 言

手性藥物對映體通常在藥理活性、代謝、穩定性和毒性等方面具有顯著性差異，當手性藥物作為外消旋混合物給藥時，一種對映體具有治療所需的藥理學作用，而另一種對映異構體不具有作用甚至有害[1]。由于手性藥物對于生物體的強烈作用以及防止手性藥物作為外消旋混合物直接銷售，手性藥物的有害對映體部分必須被徹底分離[2]。因此對映體分離在制藥領域具有重要意義[3,4]，是分析化學領域的研究熱點。液相色譜是最常用的對映體拆分方法之一，目前手性色譜固定相根據其化學類型主要包括刷型[5]、環糊精(CD)及其衍生物[6,7]、大環抗生素[8]、纖維素[9]、蛋白質[10]和金屬有機骨架(MOF)[11,12]等。

石墨烯(G)由于具有超高的比表面積和高度離域π電子共軛體系，對芳香族化合物以及其它具有共軛結構的化合物表現出較強的吸附作用和較高的吸附容量[13～16]。氧化石墨烯(GO)不僅含有豐富的含氧官能團，而且它的大離域電子系統可以為碳環結構提供強大的親和力，碳環結構在藥物、污染物和生物分子中的應用廣泛。通過共價鍵合的方式制備GO修飾的色譜柱中，GO極大地提高了固定相的比表面積、改善了所制備色譜柱的分離性能，π-π堆積作用、疏水作用和氫鍵作用等使得烷基苯、中性多環芳烴、苯酚類化合物、苯胺類化合物以及核酸堿基等均得到良好分離效果[17,18]。β-環糊精(β-CD)是具有獨特疏水性空腔的環狀低聚糖，具有大量分子的穩定包合物的優異能力[19,20]。β-CD進行手性拆分主要依賴于內部空腔對分析物的包合作用和功能基團與分析物之間的相互作用。β-CD的包合作用、空腔大小和分析物結構密切相關，當分析物的疏水基團與空腔匹配較好時，對映體選擇性較好，手性識別能力也較高[21～23]。將(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷-β-環糊精(SH-β-CD)作為手性選擇劑共價鍵合到SiO2@Au表面，制備基于SiO2@Au-SH-β-CD的色譜柱用于手性分離，實現了多種結構不同對映體的分離[24]。

親水作用色譜(HILIC)是一種以極性固定相(如硅膠、氨基鍵合硅膠等)及含高濃度極性有機溶劑和低濃度水溶液為流動相的色譜模式。作為對反相色譜的補充和正相色譜的替代，HILIC已經顯示出巨大的優勢和潛力，成為分析極性和親水性化合物的一種強有力的色譜技術[25～28]。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

TENSOR-27型傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)儀(德國布魯克公司); HT7700型透射電子顯微鏡(TEM，日本日立高新技術公司); Vario EL cube型元素分析儀(德國Elementar公司); SETARAM SETSYS16型綜合熱分析儀(法國塞塔拉姆公司)，以10℃/min的升溫速度從室溫至700℃; JSM-7500F型場發射掃描電子顯微鏡(SEM， 日本電子株式會社); FL2200-2型高效液相色譜儀(浙江福立分析儀器有限公司)。

硅膠(日本富士硅化學株式會社, 5 μm, 孔徑120?); GO(湖南豐化材料發展有限公司); 甲醇(色譜級)、乙腈(色譜級)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯亞砜(SOCl2)、甲苯、乙醇、丙酮、苯甲酸和苯甲醇(天津大茂化學試劑廠);β-CD、3-氨丙基三甲氧基硅烷(APTMS)、N,N-二環己基碳二亞胺(DCC)(阿法埃莎(中國)有限公司); 1-苯基乙醇、鹽酸普萘洛爾、安息香、布洛芬、吡喹酮、R,S-雌馬酚、酪氨酸、胸腺嘧啶、肌苷、鳥苷和腺苷(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。除特殊標明外，其它試劑均為分析純。

2.2 實驗方法

2.2.3β-CD-GO@SiO2的制備將2.38 g GO@SiO2和20 mL SOCl2混合, 75℃下加熱回流10 h，加入2.00 gβ-CD和30 mL DMF，在N2保護下加熱回流40 h。用DMF、蒸餾水洗滌3次后，干燥，得到手性固定相。β-CD-GO@SiO2固定相制備示意圖如圖1所示。

圖1 β-CD-GO@SiO2固定相制備流程圖Fig.1 Schematic diagram for preparation of β-CD-GO@SiO2 stationary phase. β-CD, β-Cyclodextrin; GO, graphene oxide; APTMS, aminopropyltrimethoxysilane; DCC, dicyclohexylcarbodiimide

2.3 色譜條件

將β-CD-GO@SiO2在60 MPa壓力下用純甲醇作為勻漿液和頂替液裝入不銹鋼管(150 mm×4.6 mm i.d.)中。所有色譜分離均在配有UV-vis檢測器的FL2200-2型HPLC系統上進行。流動相流速為1 mL/min， 柱溫為25℃。 根據公式(1)計算保留因子(k′)。

(1)

其中，t0是1,3,5-三叔丁基苯在β-CD-GO@SiO2柱上的保留時間(2.024 min)，t是柱上對映體的保留時間。

根據公式(2)計算選擇性因子(α)。

(2)

3 結果與討論

3.1 β-CD- GO@SiO2材料表征

表1 元素分析結果

Table 1 Elemental analysis results

化合物Compound元素含量 Element content (%)NCHNH2SiO22.347.062.58GO@SiO22.149.112.20β-CD- GO@SiO23.0822.583.28

圖2 紅外光譜圖: (a) NH2-SiO2，(b)GO，(c) GO@SiO2，(d)β-CD和(e) β-CD-GO@SiO2Fig.2 Fourier transform-infrared (FT-IR) spectra of (a), (b) GO, (c) GO@SiO2, (d) β-CD and (e) β-CD-GO@SiO2

圖3 GO@SiO2的掃描電鏡圖(A)和透射電鏡圖(C); β-CD-GO@SiO2的掃描電鏡圖(B)和透射電鏡圖(D)Fig.3 Scanning electron microscopy (SEM) (A) and transmission electron microscopy (TEM) (C) images of GO@SiO2; SEM (B) and TEM (D) images of β-CD-GO@SiO2

圖4 (a) GO@SiO2 和 (b) β-CD- GO@SiO2的熱重曲線Fig.4 Thermogravity curve of (a) GO@SiO2 and (b) β-CD-GO@SiO2

3.2 β-CD-GO@SiO2固定相在手性分離中的應用

3.2.17種手性對映體物質的分離β-CD-GO@SiO2色譜柱分離4種典型對映體的色譜圖如圖5所示。用k2、α和分離度(Rs)作為參數來評價該固定相的分離情況，如表2所示。由分離數據可知，7種手性物質得到不同程度的分離，并且對映體在固定相上的保留強，分離度未必高，對映體的結構對手性分離有很大影響。1-苯基乙醇的Rs>2，可能是因為1-苯基乙醇空間位阻較小。含苯環部分相對疏水容易進入空腔內部而極性較大的含手性部分處于空腔兩側[4,30]，手性中心與β-CD匹配較好，分離效果更為明顯。安息香、R,S-雌馬酚和普萘洛爾在固定相上的Rs>1.5，從結構上看，它們都有多個苯環和羥基，一方面可增強GO上共軛體系與苯環化合物的π-π堆積作用，有利于靠近β-CD，并容易進入β-CD內腔產生包合作用，促進分離; 另一方面，GO和β-CD上的羧基與羥基可與分析物形成氫鍵作用，使得Rs增加。與未鍵合GO的固定相研究相比[31,32],鍵合GO在一定程度上能提高對映體分離能力，GO參與并促進了手性分離。

圖5 4種典型手性化合物的色譜圖：(A)1-苯基乙醇，(B)普萘洛爾，(C)安息香，(D)酪氨酸。流動相比例及檢測波長同表2Fig.5 Chromatograms of four typical chiral compounds: (A) 1-phenylethanol, (B) propranolol, (C) benzoin and (D) tyrosine. The mobile phase and detection wavelength are the same as in Table 2

表2 手性化合物分離數據

Table 2 Separation data for chiral compounds

分析物Analyte檢測波長Detection wavelength(nm)流動相比例Mobile phase(%) β-CD-GO@SiO2k2αRs安息香 Benzoin254甲醇-乙腈-水 Methanol-acetonitrile-water,(30∶30∶40, V/V)20.932.101.87酪氨酸 Tyrosine278甲醇-乙腈-水 Methanol-acetonitrile-water(0.1% TEAAa), (40∶40∶20, V/V)7.202.641.29R,S-雌馬酚R,S-equol209乙腈-異丙醇Acetonitrile-isopropanol (60∶40, V/V)1.9438.81.59布洛芬 Ibuprofen254甲醇-水(0.1% 乙酸銨)Methanol-water (0.1% ammonium acetate)(56∶44,V/V)1.011.800.93普萘洛爾 Propranolol254甲醇-水(0.1%乙酸銨) Methanol-water(0.1% ammonium acetate) (64∶36, V/V)1.082.161.56吡喹酮 Praziquantel254甲醇-乙腈-水 Methanol-acetonitrile-water(40∶40∶20, V/V)2.921.811.291-苯基乙醇1-Phenylethanol254甲醇-乙腈-水 Methanol-acetonitrile-water(25∶25∶50,V/V)3.192.442.17a: TEAA, 乙酸三乙胺緩沖液(Triethylamine acetate duffer).

3.2.2溫度對手性分離的影響對映體拆分熱力學行為的研究是深入了解手性識別機理和色譜柱穩定性的有效手段。如下Van′t Hoff equation公式[33]顯示了分析物從流動相轉移到固定相的焓變(ΔH)和熵變(ΔS)。其中R，T和Ф分別是氣體常數、絕對溫度和相比。

(3)

在采用高效液相色譜分離對映體的研究中，大多數分析物在填充柱上的保留和選擇性受柱溫影響，且溶質與β-CD的結合常數受溫度的影響也很大。在低溫下，結合常數增大，但是傳質遞變會變差，所以降低柱溫可使β-CD鍵合相的選擇性增大，同時也可能使分離度改善。在20.0～60.0℃的溫度范圍內對1-苯基乙醇在手性柱上的拆分情況進行探究，分離色譜圖如圖6A所示。隨著柱溫升高，兩種1-苯基乙醇對映異構體的保留時間減少，導致k′、α和Rs值降低， 說明1-苯基乙醇的分離過程是放熱的。圖6B中的對映體Van′t Hoff equation曲線表明，1-苯基乙醇分離線性關系良好(R2>0.996)，說明手性柱的構象和對映選擇性機制與溫度無關。從lnk′-1/T直線的斜率和截距得到ΔH和ΔS(表3)。隨溫度升高，1-苯基乙醇保留時間減小，說明溫度對兩個對映體的作用機理相似，都是焓值驅動原理。

圖6 (A) 1-苯基乙醇在β-CD-GO@SiO2上的色譜分離圖，使用甲醇-乙腈-水(27.5∶27.5∶45, V/V)作為流動相，在紫外波長254 nm處檢測; (B) 在β-CD-GO@SiO2上分離1-苯基乙醇的lnk′-1/T圖Fig.6 (A) Separation chromatograms of 1-phenylethanol on β-CD-GO@SiO2, methanol-acetonitrile-water (27.5∶27.5∶45, V/V) as the mobile phase with UV detection at 254 nm; (B) lnk′-1/T plot for separation of 1-phenylethanol on β-CD-GO@SiO2

3.3 β-CD-GO@SiO2固定相在親水色譜中的應用

3.3.1流動相和柱溫對分析物保留的影響在HILIC中，流動相是影響極性及親水性分析物保留的最主要的因素。分別選擇乙腈和乙腈/甲醇作為有機相考察流動相對4種核苷小分子保留的影響。如圖7A和7C所示，當有機相含量從50%增加到80%時，4種分析物的保留逐漸增加，當有機相含量增加至90%或以上時， 分析物保留急劇增加，這是典型的HILIC保留特征。對比圖7A和7C發現，隨著有機改性劑甲醇的加入，4種分析物的保留顯著減弱，這是由于有機改性劑甲醇是質子化溶劑，與溶質分子相互競爭與β-CD和GO作用，使分析物與固定相之間的作用減弱，洗脫能力增強。但有機改性劑甲醇的加入，使得材料的親水作用增強，對于4種分析物的分離具有明顯的促進作用。

表3 ΔH, ΔS, ΔG(25℃), andR2的值

Table 3 Values of ΔH, ΔS, ΔG(25℃) andR2

圖7 不同流動相和溫度對分析物保留的影響：(A)流動相為乙腈-水; (B)流動相為乙腈-水(90∶10, V/V)； (C)流動相為乙腈-甲醇-水; (D)流動相為乙腈-甲醇-水(45∶45∶10, V/V)Fig.7 Effect of different mobile phase and temperature on the retention: (A) acetonitrile-water; (B)acetonitrile-water (90∶10, V/V); (C) acetonitrile-methanol-water; (D) acetonitrile-methanol-water (45∶45∶10, V/V)

在HILIC中，柱溫的改變可以影響擴散系數、流動相的粘度和分析物在流動相和固定相之間的轉移焓變，從而影響分析物的保留。以上述4種核苷分子為分析物，分別以乙腈-水(90∶10,V/V)和乙腈-甲醇-水(45∶45∶10,V/V)為流動相，通過改變溫度(20～60℃)研究溫度對核苷類物質保留的影響。如圖7B和7D所示，所有分析物的保留時間均隨著柱溫增加而減小。由于保留時間在很大程度上取決于柱溫，當柱溫增加時，分析物在流動相和固定相表面富集水層之間的分配系數發生變化，從而導致保留時間減小，說明分析物在色譜柱的保留行為是放熱過程。

3.3.2流動相pH值對分析物保留的影響流動相pH值也是影響分析物保留的因素之一。選擇苯甲酸、布洛芬、腺苷、胞嘧啶、苯甲醇作為目標分析物，考察它們在pH為2.8～6.3之間的保留情況。如圖8A所示， pH值在2.8～5.3時，苯甲酸和布洛芬的保留值隨著流動相pH值的增大而增大，由于它們的pKa分別為4.2和4.6，當pH值從2.8增加到5.3時，苯甲酸和布洛芬由分子狀態逐漸離解，與固定相之間的靜電作用增強，導致保留增加，當pH值繼續增加到6.3時，苯甲酸和布洛芬完全離解，離子狀態不發生變化，故而保留值不發生顯著變化。胞嘧啶和腺苷在研究的pH值范圍內，保留值隨著流動相pH值的減小而增大。這是由于腺苷和胞嘧啶是堿性物質，當pH值從6.3降低到2.8時，它們逐漸質子化，與固定相之間靜電吸引作用增強導致保留增強。pH值的變化對苯甲醇的保留影響不大。

圖8 (A) 流動相pH對分析物保留的影響; (B) 4種極性生物分子在HILIC模式下的色譜分離圖Fig.8 (A) Effect of mobile phase pH on the retention; (B)Separation chromatogram of four polar biomolecules on hydrophilic interaction chromatography (HILIC)

3.3.34種核苷小分子的分離圖8B是流動相為甲醇-乙腈-水 (45∶45∶10,V/V)、溫度為25℃時，4種生物分子的色譜分離圖，在此條件下，4種分析物實現了基線分離。由分子式可知，胞嘧啶和胸腺嘧啶分子結構相似，但胞嘧啶多1個氨基，與β-CD形成氫鍵作用，因此吸附作用增強但解析時間增加，導致保留時間變長且峰形變寬; 而胸腺嘧啶相對于胞嘧啶，與β-CD結合力弱，容易被洗脫，因而保留時間短而峰形窄。肌苷與鳥苷的分子式結構相似，而鳥苷多1個氨基，因而肌苷更容易洗脫。分析物按照胸腺嘧啶、肌苷、鳥苷、胞嘧啶的順序依次被洗脫，按照HILIC機理，溶質按極性增大的次序依此被洗脫。由于溶質在色譜上的保留是十分復雜的過程，既有在有機相和富水層之間的分配，也有氫鍵、偶極作用和靜電作用等一些復雜作用。因此，分析物的洗脫順序與其分子結構密切相關。

4 結 論

本研究成功制備了β-CD-GO@SiO2型固定相并應用于7種手性對映體的拆分，結果表明，GO和β-CD在手性識別過程中具有協同作用，氫鍵、π-π堆積作用在手性識別中具有改善分離的作用。此外，此固定相還可以作為親水色譜固定相，用于極性和親水性小分子的分離。這種固定相實現了一根柱子兩種分離模式，使用靈活，并且可以擴大分析樣品的范圍，具有良好的應用潛力。