miR-29b過表達對NIH/3T3細胞直接靶向作用及細胞功能的影響*

鄧菊紅 范翔雪 陶 然 宋啟琴 孔紅言 焦云桃 黃加權△

1.華中科技大學同濟醫學院附屬梨園醫院內科 (湖北 武漢， 430077 ) 2.華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院感染科

肝星狀細胞(HSC)的持續激活是肝纖維化發生發展過程中的關鍵環節[1]，在HSCs激活和肝纖維化過程中, 轉化生長因子β1(TGF-β1)信號轉導通路發揮重要作用[2]。microRNA29b(miR-29b)是新近發現的一類與纖維化疾病密切相關的小分子RNA家族成員之一。諸多研究發現miR-29b可通過直接抑制多種細胞外基質蛋白表達和調控多種信號通路參與纖維化過程[3,4]。在肝纖維化過程中,不僅miRNAs可作用于TGF-β1信號轉導通路影響TGF-β1發揮作用,而且TGF-β1也能通過調節miRNAs的表達來行使功能。本研究旨在探討miR-29b靶向調控COL1α1及COL3α1的表達及作用機制，為進一步探索其在肝纖維化中的作用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料 NIH/3T3細胞系(小鼠成纖維母細胞)，購自武漢大學中國典型培養物保藏中心。重組人轉化生長因子(TGF)-β1購自北京達科為生物技術有限公司；miR-29b mimics/miR-NC、miR-29b /U6擴增引物，均購自廣州銳博生物科技有限公司；兔源性Collagen I/CollagenIII單克隆抗體、山羊抗兔熒光二抗、羊抗兔IgG，均購自武漢博士德生物工程有限公司；兔源性HSP47抗體、鼠源性α-SMA/TIMP-1/MMP-9抗體，均購自Santa Cruz Biotechnology公司；逆轉錄試劑盒、SYBR Green I Master mix，均購于日本ToYoBo公司；脂質體轉染試劑盒(lipo 2000)購于美國Invitrogen公司；Cell Counting Kit-8(CCK-8)試劑盒購于日本同仁化學研究所；凋亡試劑盒購于南京凱基生物科技發展公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 雙熒光素酶基因報告分析 培養共轉染miR-29b mimic/miR-NC質粒的NIH/3T3細胞，用PBS洗兩次，經裂解離心取上清后用雙熒光素酶報告分析系統分析相對熒光素酶活性(螢火蟲熒光素酶活性∶腎素熒光素酶活性)。

1.2.2 NIH/3T3細胞培養與轉染 NIH/3T3細胞在含10%胎牛血清的DMEM培養基中進行培養，放置于37℃、5% CO2培養箱中生長至細胞融合度達80%～90%時進行細胞傳代。轉染前一天按2×105/ml將對數生長期細胞接種于6孔板內培養，細胞融合度80%～90%即可轉染。將鋪板細胞分為6組：空白對照(Control)組，miR-29b mimic組，miR-NC組，TGF-β1組，TGF-β1+miR-29b mimics組，TGF-β1+miR-NC組。按照lipo2000試劑盒說明書進行miR-29b mimic/miR-NC轉染。其中Control 組細胞常規培養，TGF-β1組加入含10ng/L TGF-β1的DMEM培養基，TGF-β1+miR-29b mimics/ miR-NC組是在轉染miR-29b mimics/ miR-NC后培養4～6h，然后換用含10ng/L TGF-β1的新鮮完全培養基，培養48h收集細胞。

1.2.3 熒光實時定量PCR檢測轉染效率及纖維化相關因子基因表達 參考TRIzol(Invitrogen公司)說明書抽提總RNA。①檢測轉染效率：以U6為內參基因，反應體系為：5μM miR-29b/U6上下游引物各0.8μl，模板2μl，SYBR Green I Master Mix 9μl，RNase-free Water加至20μl。實時定量PCR儀(美國Roche公司)程序設置：95℃ 20s，(95℃ 10s，60℃ 20s，70℃ 10s)，共39個循環;行融解曲線分析，設定溫度為70℃～95℃，升溫速率為 0.4℃/次，恒溫時間為 1 s/次。②檢測相關纖維化指標：以GAPDH為內參，引物序列見表1，反應體系為：10μM上下游引物各0.4μl，模板1μl，SYBR Green I Master mix 10μl，RNase-free Water補充至20μl，程序設定為：95℃ 30s，(95℃ 5s，58℃ 5s，72℃ 15s)，共40個循環，根據所獲循環閾值(CT)分析基因相對表達水平。

1.2.4 Western-blot檢測纖維化相關指標蛋白表達 蛋白抽提試劑提取各組細胞總蛋白，Bradford蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，用PVDF膜轉膜2h，BSA溶液封閉1h,加一抗4℃孵育過夜。次日 TBST洗膜后加二抗孵育慢搖1h，TBST洗膜20min×3次，采用ECL顯色液和成像系統于暗室曝光，檢測目的蛋白的表達情況。掃描圖片，ImageJ分析軟件將特異條帶灰度值數據化。

1.2.5 免疫熒光染色檢測纖維化相關蛋白表達 NIH/3T3細胞培養、鋪板及轉染miR-29b mimics/ miR-NC步驟同前，轉染48h后PBS漂洗、甲醇固定15min，再用PBS清洗。BSA封閉液室溫孵育30min后，分別滴加COL1α1抗體、COL3α1抗體、IgG，濕盒內4℃孵育過夜。次日PBS清洗，避光加入熒光二抗，37℃孵育40min后PBS清洗。DAPI染核，避光孵育15min，PBS清洗后熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集轉染后48h各組細胞，用PBS清洗細胞兩次(2000rpm離心5min)，收集1～5 ×105細胞，加入500μl Binding Buffer懸浮細胞，加入5μl AnnexinⅤ-FITC混勻后，加入5μl Propidium Iodide混勻，室溫避光反應5～15min；1h內用流式細胞儀檢測，激發波長488nm，發射波長530nm。實驗結果以百分率表示。

1.2.7 CCK-8法檢測NIH/3T3細胞增殖活力 96孔板各孔中加入100μl細胞懸液，待細胞生長至60%～70%融合時轉染，實驗分組同上，分別于轉染24h、48h、72h檢測細胞增殖活力。吸出96孔板中的培養基，每孔加入100μl含10%CCK8的培養基，在培養箱中孵育0.5～1h，酶標儀測定450nm處的吸光度，細胞活力(%)=(A加藥-A空白)/( A0加藥-A空白)×100%，其中A加藥為具有細胞、質粒和(或)TGF-β1的孔吸光度，A空白為沒有細胞的孔吸光度，A0加藥為僅有細胞而沒有質粒和(或)TGF-β1的孔吸光度。

1.3 統計學方法 實驗數據以Mean±SEM表示，應用GraphPad Prism 5.0進行統計學分析，兩組間均數的比較采用Student-t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-29b對COL1α1及COL3α1靶向調控作用驗證 通過生物信息學分析發現miR-29b可與COL1α1及COL3α1 3′UTR互補結合。進一步通過雙熒光素酶基因報告證實miR-29b可與COL1α1及COL3α1 3′UTR特異性結合，抑制其表達。

2.2 miR-29b轉染效率 轉染48h，靶基因miR-29b的相對表達量為(221.462±2.358)，與miR-NC組、Control組比較均顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.001，見圖1)。

圖1 轉染48h后NHI/3T3細胞miR-29b表達情況

2.3 過表達miR-29b對NIH/3T3細胞膠原COL1α1、COL3α1 mRNA及蛋白表達的影響 轉染48h后，與miR-NC組相比，miR-29b mimics組CollagenⅠ、Ⅲ表達顯著減少(見插頁圖2)，COL1α1 mRNA相對表達量(2.696±0.15)顯著下調(圖3A，P<0.01)，COL3α1 mRNA相對表達量(1.884±0.064)亦顯著下降(圖3B，P<0.05);Western Blot檢測示，與miR-NC組比較，miR-29b mimics組 Ⅰ 型和Ⅲ型前膠原蛋白表達均明顯下調(0.42vs0.56, 0.17vs0.24，P﹤0.05，圖3C)。

A.COL1α1 mRNA表達情況 B.COL3α1 mRNA表達情況

C.COLⅠ/Ⅲ蛋白表達情況

2.4 過表達miR-29b對TGF-β1致NIH/3T3細胞形態變化的影響 RT-PCR顯示，miR-29b mimics轉染NIH/3T3細胞4～6h后，再經TGF-β1 10ng/ml干預48h，與Control組、TGF-β1組及TGF-β1 +NC組相比，miR-29b表達顯著上調(與Control組比較，P<0.05；與TGF-β1+miR-29b mimics比較，P<0.001;圖4)。鏡下觀察，Control組細胞排列緊密，呈“星芒狀”貼壁生長，胞內富含大量脂質小滴，TGF-β1作用后細胞內脂滴消失，體積逐漸變大變長，呈長梭形，排列紊亂，幾乎無細胞脫落。miR-29b mimics作用48h后，細胞生長稀疏，體積逐漸變大變長，大量細胞脫落死亡(見插頁圖5)。

圖4 不同處理條件下NIH/3T3細胞miR-29b相對表達量分析

2.5 過表達miR-29b下調TGF-β1對NIH/3T3細胞肝纖維化指標mRNA及蛋白表達的影響 RT-PCR結果顯示，miR-29b mimics轉染NIH/3T3細胞4～6h后再經TGF-β1 10ng/ml處理48h，與TGF-β1組和TGF-β1+NC組相比，COL1α1、 COL3α1、α-SMA、HSP47、TIMP-1 mRNA表達下調，而MMP-9 mRNA表達上調(與Control組相比,#P<0.05,##P<0.01；與TGF-β1組相比，*P<0.05,**P<0.01)(圖6)。Western Blot結果與RT-PCR結果基本一致(圖7)。

圖6 不同處理條件下NIH/3T3細胞肝纖維化指標mRNA表達變化

圖7 不同處理條件下NIH/3T3細胞肝纖維化指標指標蛋白表達變化

2.6 過表達miR-29b對NIH/3T3細胞增殖的影響 CCK-8檢測結果顯示，TGF-β1組及TGF-β1+miR-NC組細胞增殖率逐漸上升，均高于TGF-β1+miR-29b mimics及Control組(P<0.05，見圖8)。

圖8 不同處理條件對NIH/3T3細胞增殖的影響

圖9 不同處理條件對NIH/3T3細胞凋亡的影響

2.7 轉染miR-29b mimics對NIH/3T3細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果提示，與其它各組相比，TGF-β1+miR-29b mimics組細胞凋亡率顯著升高，差異具有統計學意義(P<0.05)，見圖9。

3.討論

HSC活化是肝纖維化發生的主要驅動因素，可以導致ECM的合成和降解失衡，引起ECM過度沉積，進一步向肝硬化發展[5]，在此過程中伴隨有microRNA的變化[6]。Roderburg等[7]發現在肝內多種細胞中，miR-29b在星狀細胞中表達最高，是其在肝細胞、庫弗氏細胞及內皮細胞中的100多倍。近期研究表明，miR-29b與纖維化疾病密切相關，miR-29b在各種纖維化疾病中表達都明顯下調，其過表達可以抑制膠原蛋白及金屬蛋白酶的表達[8,9]，但miR-29b是否能對膠原纖維進行調控從而在纖維化疾病發病過程發揮重要作用尚不清楚。

生理狀態下，NIH/3T3細胞表達一定量的miR-29b，我們發現，給予miR-29b mimics干預后，miR-29b表達顯著上調，同時Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達均明顯降低。藉此本研究中的miR-29b mimics可以作為研究靶向上調miR-29b基因后觀察該基因效應的目標分子。我們通過熒光雙染色酶基因報告分析發現只有WT(野生型)COL1α1及COL3α1的3′UTR的啟動子區域可以和miR-29b結合，證實了miR-29b可以對COL1α1及COL3α1 mRNA表達靶向調控。

多種細胞因子參與肝纖維化的發生發展過程，其中TGF-β1是最關鍵的致纖維化細胞因子。TGF-β1具有多種生物學功能，一方面參與調控細胞增殖、分化和細胞外基質形成，另一方面在生物體血管形成、免疫調節、組織修復、胚胎發育、腫瘤發生等生理病理過程中發揮重要作用[10,11]。TGF-β1不僅促進ECM基因激活轉錄并高表達，還通過抑制金屬蛋白酶(MMP)和促進組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)減少異常合成的ECM降解,從而加重ECM在損傷組織、器官的沉積。我們以TGF-β1干預NIH/3T3細胞作為體外研究肝纖維化病變發生機制的細胞模型，研究發現過表達miR-29b對TGF-β1致NIH/3T3細胞COL1α1、COL3α1、α-SMA、TIMP-1、HSP47等表達升高有抑制作用，說明miR-29b可能不僅僅局限于通過調控膠原蛋白的表達而抑制纖維化，在肝纖維化過程中它可能有更廣泛的抑制纖維化機制，研究以何種方式參與調節尚不清楚。

HSP47作為膠原的“分子伴侶”，能與多種類型膠原和前膠原特異性結合，參與前膠原在內質網中修飾、折疊、裝配等整個加工過程，從而在肝纖維化進程中起重要作用[12]。本研究表明，miR-29b過表達可抑制TGF-β1所致HSP47表達下調，其具體機制尚需進一步的研究。Sekiya等[11]運用WST-1分析結果顯示，miR-29b具有抑制HSC增殖及活性作用，此外，miR-29b可能調控HSC的數目。與此類似，我們的CCK-8細胞檢測及Annexin-FITC細胞凋亡檢測結果顯示miR-29b顯著影響NIH/3T3細胞的增殖及凋亡，轉染miR-29b mimics抑制TGF-β1刺激NIH/3T3細胞的增殖及增加細胞凋亡。其具體調節機制尚需進一步研究。

我們認為miR-29b表達增高可以抑制肝臟纖維化，其抑制纖維化作用不僅與其調控膠原蛋白有關，而且還影響TIMP-1、MMP-9、HSP47，α-SMA的表達。此研究結果表明，在肝纖維化的發生、發展過程中，TGF-β1與miRNAs相互作用起到了重要作用。一方面有利于從更開闊的視野深入了解TGF-β1的作用機制；另一方面也為使用相應的miRNAs，增強或阻斷TGF-β1信號通路轉導，從而為探索肝臟纖維化發病機制和治療提供新思路、新方法。