微波輔助蛋白質(zhì)水解-反相高效液相色譜法測定飼料中的色氨酸

趙 艷 ， 宋 軍 ，3*， 張艷紅 ， 楊發(fā)樹 ， 張鳳枰 ， 劉耀敏

（1.四川威爾檢測技術(shù)股份有限公司，四川成都 610041；2.通威股份有限公司，四川成都 610093；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西楊凌 712100）

色氨酸通常以游離或結(jié)合態(tài)廣泛存在于生物體中，是人類和動物必需的8種氨基酸之一，其作為一種功能性的氨基酸，在提高動物的攝食量、生長性能，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收等方面發(fā)揮著重要的作用 (王榮發(fā)等，2011；陳娥英等，2006；蘇有健等，2005）。因動物體本身不能合成色氨酸，所以飼料中色氨酸的平衡和補(bǔ)充就顯得十分重要，而準(zhǔn)確檢測飼料及其原料中色氨酸的含量，對于保證飼料的質(zhì)量具有重要意義。目前，測定色氨酸的方法有多種，包括分光光度法 (徐禮生等，2014）、毛細(xì)管電泳法 (楊曉云等，2001）、電化學(xué)法 (楊曉云等，2001）、氨基酸分析儀法（Li等，2015）、反相高效液相色譜法 (楊永麗等，2016； 李成成等，2016；Cevikkalp 等，2016；Yust等，2004）和高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 （王佳佳等，2016；徐開成等，2016）等，其中以反相高效液相色譜法最為常用。色氨酸通常以蛋白質(zhì)的形式存在于樣品中，首先需要進(jìn)行水解，解離為游離態(tài)后才能測定。目前通常用常規(guī)堿水解法（GB/T 18246-2000，2001）。然而常規(guī)堿水解方法耗時，步驟繁瑣，且水解過程不易控制。而采用微波輔助蛋白質(zhì)水解樣品，快速、簡便，特別是易于控制堿水解條件，重現(xiàn)性好。國內(nèi)外采用微波輔助蛋白質(zhì)水解-反相高效液相色譜法測定飼料中色氨酸的報道甚少，本文充分利用微波蛋白質(zhì)水解儀的優(yōu)勢，既節(jié)約了試劑，又節(jié)省了樣品前處理時間，旨在為飼料中色氨酸的質(zhì)量控制提供一種檢測方法選擇。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑和材料 Thermo U3000超高效液相色譜儀，DAD檢測器，Chromeleon色譜管理系統(tǒng)，美國Thermo Scientific公司；CP225D電子分析天平，德國Sartorius公司；ETHOS 1微波水解儀，意大利Milestone公司；Allegra 64 R離心機(jī)，BECKMAN COULTER公司；KQ 5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

L-色氨酸（L-Trp，純度 99.5%）標(biāo)準(zhǔn)品，美國sigma-Aldrich公司；乙腈、甲醇（色譜純），美國Fisher公司；磷酸二氫鉀、乙酸鈉（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；其他試劑均為優(yōu)級純；水為Milli-Q Gradient超純水。

飼料原料及成品：四川當(dāng)?shù)仫暳鲜袌霾杉?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品100.0 mg（純度 99.5%），用適量水和數(shù)滴0.1 mol/L的氫氧化鈉溶解，并用水定容至100 mL，配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，可根據(jù)需要稀釋成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 HPLC分析條件 色譜柱：Syncronis C18色譜柱，250 mm×4.6 mm，5 μm； 流速：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測器：DAD檢測器，檢測波長：220 nm；流動相：等度洗脫，0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液+乙腈＝90+10（V+V）。

1.4 供試樣品溶液的制備

1.4.1 常規(guī)堿水解法 參照國標(biāo)GB/T 18246-2000堿水解方法進(jìn)行樣品前處理。所有樣品重復(fù)3次測定，結(jié)果取平均值。

1.4.2 微波輔助蛋白質(zhì)堿水解法 將樣品粉碎，準(zhǔn)確稱取樣品20 mg（精確至0.01 mg）于聚四氟乙烯管中，加入5 mol/L氫氧化鈉溶液0.5～1 mL，依次放置于水解槽中，水解主控罐內(nèi)加入5 mol/L氫氧化鈉溶液120～150 mL，蓋好水解罐。將水解罐放入密封裝置中，擰緊，插入溫度傳感器，抽真空，充入高純氮氣以保護(hù)樣品，重復(fù)3次。在1000 W功率條件，常溫-160℃升溫20 min，160℃溫度保持30 min，當(dāng)溫度冷卻至室溫后打開密封裝置，取出水解槽，將微波水解瓶逐一取下后，將水解液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用6 mol/L的鹽酸溶液調(diào)至中性，超純水定容至25 mL。搖勻后，10000 r/min 離心 10 min，過 0.22 μm 濾膜，待高效液相色譜上機(jī)檢測。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的選擇

2.1.1 微波輔助蛋白質(zhì)水解條件的優(yōu)化 考察不同微波水解溫度（140、150、160、170 ℃），以及不同微波水解溫度保持時間（20、30、40 min）對實驗結(jié)果的影響，最終選擇160℃溫度保持30 min為最佳條件。

2.1.2 微波堿水解法與常規(guī)堿水解法的比較 為證明方法的可靠性，在采用微波堿水解測定樣品中色氨酸含量同時，運用國標(biāo)GB/T 18246-2000的常規(guī)堿水解法110℃水解20 h進(jìn)行測定，并將測得的結(jié)果用T檢驗法進(jìn)行了比較，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，兩種水解方法測定結(jié)果的相對偏差均小于3.0%，經(jīng)T檢驗，微波堿水解法與國標(biāo)方法常規(guī)堿水解法測定結(jié)果不存在顯著差異（P＞0.05），在所選擇的條件下微波輔助蛋白質(zhì)堿水解測定結(jié)果與國標(biāo)方法常規(guī)堿水解法一致。

表1 兩種水解方法色氨酸含量的比較（n=3）%

2.2 高效液相色譜分析條件的選擇

2.2.1 波長的選擇 利用DAD二極管陣列檢測器獲得色氨酸光譜數(shù)據(jù)，得出其在190～800 nm范圍內(nèi)的最大吸收波長。色氨酸在220 nm和280 nm波長下有較強(qiáng)吸收，220 nm比280 nm的響應(yīng)高6倍，因此，選用220 nm作為檢測波長，從而降低色氨酸的檢出限。

2.2.2 流動相的選擇 為了使色氨酸與其他組分達(dá)到完全分離，分別以甲醇/水、甲醇/乙酸鈉溶液、甲醇/磷酸、甲醇/磷酸二氫鉀溶液、乙腈/磷酸二氫鉀溶液作為流動相，考察這些體系對色氨酸分離情況的影響。結(jié)果表明，選擇甲醇/乙酸鈉溶液體系時部分飼料中的雜質(zhì)會對色氨酸的分離造成干擾，在改用乙腈/磷酸二氫鉀溶液作為流動相后，分離情況大為改觀，而且用乙腈作流動相可以大大降低流動相的背景干擾。另外，研究了乙腈體積分別為5%，10%和15%時，色氨酸的出峰效果。結(jié)合色氨酸的保留時間，色譜峰的對稱因子，干擾情況等一系列實驗，最終選擇乙腈/磷酸二氫鉀溶液（10∶90，V/V）作為流動相。本實驗在所選擇的條件下，標(biāo)準(zhǔn)品和飼料樣品的分離效果見圖1和圖2。

圖1 色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

圖2 飼料中色氨酸的色譜圖

2.3 線性關(guān)系及檢出限的考察 分別準(zhǔn)確吸取適量色氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，用水配制成濃度分別為 0.2、2.0、4.0、20.0、40.0 μg/mL 的色氨酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。按照上述色譜條件進(jìn)樣，以色氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），對應(yīng)的峰高為縱坐標(biāo)（y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。回歸方程：y=3.3965x＋0.0937，相關(guān)系數(shù)為1.0000，表明濃度為0.2～40 μg/mL時線性關(guān)系良好。以3倍信噪比計算檢出限，以10倍信噪比計算定量限，本方法檢出限為0.025 mg/g，定量限為0.075 mg/g。

2.4 方法的精密度和回收率實驗 為研究方法的精密度和可靠性，在不同種類的飼料樣品中分別添加3個濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每水平6個平行樣，按照1.4.2樣品溶液制備方法進(jìn)行處理，按照1.3儀器條件進(jìn)行測定，回收率結(jié)果見表2。結(jié)果顯示，色氨酸的回收率為93.0%～95.5%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.26%～2.72%，符合實驗要求。

表2 色氨酸的回收率和測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）

2.5 樣品中色氨酸的測定 按上述方法，分別測定飼料原料及成品中的色氨酸含量，結(jié)果見表3。

表3 樣品中色氨酸含量測定結(jié)果（n=4）

3 結(jié)論

利用微波輔助蛋白質(zhì)水解-反相高效液相色譜法測定飼料中的色氨酸，方法簡便快速、重現(xiàn)性好、分離效果良好、靈敏度高、檢測結(jié)果可信度高，可以滿足飼料及其原料中色氨酸的檢測需要，同時為飼料配方調(diào)整提供理論依據(jù)，對于指導(dǎo)飼料企業(yè)生產(chǎn)、加強(qiáng)飼料產(chǎn)品控制具有十分重要的意義。