低頻電磁場模擬腦電節律儀對SD大鼠腦含水量及外周血IL－6和TNF－α的影響＊

郭紅燕，張金濤，李乃義，王鳳嬌，劉勝松

低頻電磁場模擬腦電節律儀，是筆者所在醫院自主研制并獲得國家專利（國家實用新型專利公開號：CN201320347）的儀器。此儀器采用低頻電磁場輻射方式進行設計，通過模擬腦電節律的電磁場對腦進行刺激，是治療神經、心理、精神疾病的新手段［1］，用于治療軍人心理應激反應效果顯著［2］。 為進一步驗證其應用安全性，該研究采用腦電節律儀干預正常SD大鼠后，觀察其對腦水腫和外周血IL－6、TNF－α的表達的影響。

1 材料與方法

1．1 一般資料

1.1.1 實驗動物及分組 購于北京維通利華實驗動物技術公司的SD大鼠60只，雌雄各30只，健康清潔級，8 周齡，體重（230±20） g，控制動物房 12 h白黑交替，溫度為（23±2）℃，適應性喂養1 W。先將正常SD大鼠隨機分為四組，每組15只，實驗組在每日固定時間進行干預，發射源固定于清醒態大鼠顱頂骨外約2 cm處，1次/d，每次0.5 h，分別為正常對照組（A組），每日置于相同的固定裝置內不予以治療；1 HZ 組 （B 組）；10 HZ 組（C 組）；20 HZ 組 （D組），每日均在固定時間干預，30 min/d，連續7 d。

1.1.2 實驗試劑及設備 酶聯免疫檢測試劑盒（IL－6購于南京建成生物工程研究所、TNF－α購于依科賽生物科技有限公司）、低頻電磁場模擬腦電節律儀（解放軍第八十八醫院）、臺式冷凍高速離心機（德國 Eppendorf 5810R）、電恒溫烤箱（江蘇太倉市實驗廠）、全自動酶標儀 （美國Biotek ELX800UV）、全自動洗板機 （美國 Biotek ELX50/6）、超純水系統（英國 Elga Puelab Bioscien）、漩渦混勻儀（美國 SCI Vortex）、超低溫冰箱（－80 ℃，丹麥 Heo－Holten 3410）、單通道精密移液器 （德國Eppendorf Research）。

1.2 方 法

1.2.1 標本采集 干預結束后進行標本采集，在室溫25℃條件下，用10%水合氯醛0.4 ml/100 g行腹腔麻醉注射。麻醉成功后，大鼠仰臥固定四肢，在胸骨左側心臟搏動最強點穿刺，用抗凝采血管抽血約5 ml，混勻后高速離心機3000轉/min離心10 min后取上清液，分裝于離心管內，凍存于－80℃冰箱留待批量指標檢測，采血完成后快速從上頸椎處剪斷頸髓，剪除顱骨小心剝離腦膜，從延髓開始分離輕輕取出整腦，稱腦濕重。置于100℃烤箱烤24 h，稱腦干重。

1.2.2 腦組織含水量測定 大鼠麻醉后迅速斷頭取腦。用濾紙吸除腦組織表面的水分，電子分析天平（精確至0.001 g）稱取濕重（W），再將腦組織置于100℃的恒溫干燥箱烘烤24 h稱取其干重（D）。應用Elliot公式計算腦組織的含水量：腦組織含水量（%）（BWC）=（濕重－干重）/濕重×100%。

1.2.3 血清學ELISA指標檢測 （1）室溫解凍血清標本后備用。（2）自試劑盒中取出所需酶標板條，室溫復溫30 min，將剩余板條密封放回4℃冰箱保存。（3）標準品的配置：1、2、3、4、5 號 IL－6 標準品依次為 5 ng/L、10 ng/L、20 ng/L、40 ng/L、80 ng/L。1、2、3、4、5、6、7、8 號 TNF－α 標準品依次為 0 pg/ml、31.25 pg/ml、62.5 pg/ml、125 pg/ml、250 pg/ml、500 pg/ml、1000pg/mL、2000pg/mL。 （4）設置好樣本孔、標準品孔和空白孔，做復孔。（5）加樣：①空白孔不加樣品、生物素標記的抗 IL－6（TNF－α）抗體、鏈霉親和素－HRP，只加顯色劑和終止液，其余各部操作相同；②標準品孔加標準品50μl、鏈霉親和素－HRP50μl；③樣本孔先加待測樣本40μl，再加生物素標記的抗 IL－6（TNF－－α）抗體 10 μl、鏈霉親和素－HRP50μl， 蓋上封板膜，IL－6在 37℃恒溫箱溫育 60 min（TNF－α 室溫 120 min）。 （6）配液：將濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋成20×應用液，備用。（7）洗滌：到時間后，棄去孔內液體，并用吸水紙吸干，入洗板機重復洗板5次，拍干。（8）顯色：每孔顯色劑A、B各 50 μl，混勻，37℃避光孵育 10 min。（9）終止：各孔加入終止液50μl，終止反應 （此時藍色立轉黃色）。（10）測定：以空白孔調零，終止反應10 min內

測定，450 nm波長通過酶標儀測定各孔的OD值。（11）實驗結果計算：以酶標孔中標準品的吸光度值通過作圖，繪制標準曲線（X軸為標準品濃度，Y軸為相應的吸光度值），并根據樣品吸光度值在該曲線圖上分別求得相應的大鼠血清學IL－6與TNF－α的濃度。

1.2.4 統計方法 應用SPSS 18.0統計分析軟件處理數據。計量資料用均數±標準差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析（F檢驗）。均數兩兩比較采用LSD法 （最小顯著差異法），P≤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實驗動物一般情況分析 整個實驗過程，無動物傷亡事件，精神飲食均正常，活動正常，大小便正常，實驗組與正常對照組的大鼠體重均呈持續增長狀態。

2.2 IL-6的ELISA檢測結果 正常對照組在血清中含量較低；各實驗組中含量表達無明顯變化，與正常對照組比較（P=0.999），差異無統計學意義。見表1。

表1 大鼠外周血IL-6的表達（濃度）結果

2.3 TNF-α的ELISA檢測結果 正常對照組在血清中含量較低；實驗組中含量表達無明顯變化，與對照組比較（P=0.935），差異無統計學意義。見表2。

表2 大鼠外周血TNF-α的表達（濃度）結果

2.4 干預后大鼠腦組織的干濕重變化 A組、B組、C組、D組大鼠腦組織含水量分別為77.45±0.009、77.58±0.008、77.54±0.009、77.65±0.009 （P＞0.05），組間比較差異無統計學意義。見表3。

表3 大鼠腦含水量的表達結果

3 討論

腦電節律儀在治療精神疾病方面具有一定的應用價值，其原理主要是：通過誘導使大腦的兩半球進入一種同步的狀態（brain sync），即腦波同步狀態，并誘發人腦產生α、β、θ、δ頻率的腦電波，這幾種腦電波與人的精神狀態有著至關重要的聯系［1］。目前，通常采用的誘導方式主要是通過聲光刺激與低頻電脈沖刺激；與之不同，筆者研制的腦電節律同步調節儀主要采用了低頻電磁場輻射方式，通過人工制造的腦電節律電磁場對人體腦部進行刺激誘導［2］。近年研究發現，經顱磁刺激可以改善慢性應激抑郁模型大鼠的抑郁行為及海馬神經元的凋亡［3］，并對可促進腦梗死后空間學習記憶功能恢復［4］；筆者之前通過水迷宮數據的變化研究也發現，采用模擬腦電節律儀的低頻電磁場對正常大鼠的認知功能無不良影響，可能有改善作用［5］。

近年研究表明腦組織的損傷與炎癥反應相關［3，4］。IL－6、TNF－α為促炎癥性細胞因子，主要調節免疫應答，參與免疫細胞發育、刺激造血、介導炎癥反應及參與組織修復等。IL－6是具有促進生長和分化等調節功能的炎癥細胞因子，主要生物學功能是作為細胞分化因子，促進各類免疫細胞和造血細胞的分化、增殖，并介導急性炎癥反應。在機體生理或病理條件下都發揮重要作用，不僅作用于免疫系統，還廣泛作用于神經［5］、內分泌和心血管等系統。脈絡叢室管膜細胞、血管內皮細胞、星形細胞、小神經膠質細胞及神經元等中樞神經細胞在不同損傷或刺激下可產生IL－6。大量的資料表明，在正常情況下腦內IL－6僅有低水平表達，腦損傷后表達明顯增加。在腦損傷的早期IL－6水平明顯增高，對中樞神經系統炎癥與腦水腫的發生發展、神經元的退變和丟失以及中樞神經系統的免疫方面起著重要作用，而晚期IL－6水平再次升高，促進了腦組織的再生和修復，并可誘導腦微血管內皮細胞增生和血管的形成［6］。目前研究表明IL－6的作用可能通過以下機制：IL－6 與其受體（IL－6Ra）結合后，識別信號轉導成分gp130，三者共同形成生物活性的三元復合體，該復合體激活細胞內的多種激酶，導致蛋白磷酸化和基因表達，進而發揮生物學作用。腦損傷后，不同實驗動物腦組織、腦脊液和血清中均可以檢測到IL－6 和 IL－6 受體水平升高［7］。 IL－6 水平增高可以出現在中樞神經系統創傷及感染性病患中。在顱腦損傷早期神經膠質細胞可以產生IL－6等細胞因子，使神經系統及外周血中IL－6的含量顯著增高［8］。

TNF－α是被激活的巨噬細胞分泌的一種前炎癥細胞因子，是炎癥反應重要的起始因子之一。TNF－α可在全身發揮作用，具有廣泛而復雜的生物學活性，釋放增加引起多核白細胞激活聚集并釋放炎癥介質，誘導缺血神經元壞死和凋亡。TNF－α細胞來源極為廣泛，各種免疫細胞、內皮細胞、成纖維細胞、表皮細胞、角質細胞、平滑肌細胞以及急性腦缺血后的小膠質細胞、星形膠質細胞、神經元等均可分泌TNF－α。TNF－α作為致炎因子通過誘發和促進炎癥、細胞毒性、凝血等多種凋亡途徑加劇缺血損傷［9］。損傷后TNF－α快速升高，具有神經毒性作用，加速神經死亡。TNF－α還加重腦水腫，損傷血腦屏障，促進趨化因子的生成，誘導白細胞聚集，產生大量的有害物質。動物實驗表明［10］，腦損傷發生后，血漿及腦組織 TNF－α、IL－6含量均出現變化。細胞因子 IL－1β，TNF－α，IL－6，IL－8 等通過炎癥細胞的活化，使血腦屏障（blood brain barrier，BBB）的通透性增加［11］。TNF－α早期主要通過對毛細血管的直接毒性作用，使毛細血管的通透性增加，開放BBB，導致腦水腫。

既往研究表明，經顱磁刺激能利用時變磁場產生感應電場，引起生物電流在組織中傳導，使得神經纖維、神經元和肌肉去極化，用以改變皮質神經細胞的動作電位，影響腦內代謝和神經電活動［12，13］。經顱磁刺激治療廣泛性焦慮障礙的療效顯著［14］；趙琳等研究經顱磁刺激可以改善慢性應激抑郁模型大鼠的抑郁行為及海馬神經元的凋亡［15］。張靖慧等研究發現經顱磁刺激對可促進腦梗死后空間學習記憶功能恢復，并可能通過增加患側海馬區IL－1βmRNA表達來實現［16］。而經顱磁刺激對正常大鼠周圍血TNF－α、IL－6的影響鮮有報道。筆者所在醫院自主研制的腦電節律儀其作用機制是：采用低頻電磁場方式制造的腦電節律對腦部進行刺激，利用反饋原理起安眠、精神松弛等治療效果，為治療精神疾病及心理疾病提供了新手段，而且不存在藥物依賴及不良作用。

該研究進一步通過干預正常大鼠，觀察了該節律儀所采用低頻電磁場對腦含水量及外周血白介素－6、TNF－α的影響。研究發現，與對照組比較，實驗組在每日固定時間，1次/d，30 min/次，連續7 d進行低頻電磁場輻射后，1 HZ組 （B組）；10 HZ組（C組）；20 HZ組（D組）大鼠腦組織含水量組間比較差異無統計學意義；正常對照組在血清中IL－6、TNF－α含量均較低；低頻電磁場輻射1周后各實驗組中含量表達無明顯變化，組間差異無統計學意義，說明腦電節律儀對正常大鼠周圍血清中的TNF－α、IL－6含量無明顯影響，既沒有破壞血腦屏障導致腦水腫，又未啟動機體的炎癥免疫反應，對大鼠具有安全性。該研究探討了TNF－α、IL－6因子結合腦水腫反映其安全性，但是有關確切機制和臨床還有待進一步驗證。