12種真菌鉀離子通道蛋白生物信息學分析

周 威,辛董董,趙巖巖,胡梁斌,莫海珍,李紅波

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

真菌作為真核生物中一個龐大的類群,與人們的生活有著密切關系。香菇、木耳等大型真菌是人類的重要食物來源,米曲霉、釀酒酵母等是食品工業生產中重要的發酵菌種[1]。而黃曲霉、禾谷鐮刀菌等病原性真菌卻侵染糧食作物,危害食品安全、甚至人類健康[2-3]。抗真菌藥物大量使用帶來真菌耐藥性日益嚴重,了解真菌耐藥性機制、尋找新的抑制靶點有著重要的意義[4-5]。細胞內K+穩態是多數生物代謝機制和綜合性能優化運行的先決條件。胞內K+動態平衡由細胞質和細胞膜上的許多K+通道和轉運蛋白所調控[6]。在孢子萌發早期階段,膜通透性增加,導致孢子內離子和水重新分配,孢子內80%的K+快速釋放到孢子外,隨后K+依賴能量被再次吸收[7]。而離子的移動往往涉及到離子通道的響應,這也是細胞識別外界信號的一個重要途徑。鉀離子通道蛋白在不同的真菌中分布廣泛,目前已在釀酒酵母、米曲霉、煙曲霉等真菌中發現許多鉀離子通道蛋白。鉀離子通道是離子通道中種類最多。鉀離子通道是目前存在最廣泛且最復雜的

一大類鉀離子通道,與多種生命活動密切相關,是藥物設計的重要靶標之一[8]。對于鉀離子通道結構和功能的研究主要通過實驗的方法進行的,比如人工膜離子通道重建技術、細胞膜片鉗和單通道記錄技術、通道蛋白分離、基因重組技術、純化等生化技術。在理論方面,對鉀離子通道的研究主要有動力學模擬方法和序列分析方法。目前關于真菌的鉀離子通道蛋白,研究較少。Gobert等[9]通過敲除和過表達擬南芥中鉀離子通道TPK1,發現TPK1對保持胞內K+動態平衡起著重要作用,能夠影響種子的萌發、生長和氣孔運動。敲除擬南芥花粉管K+通道AKT6后,花粉管萌發率與野生型相比大幅度降低,并且AKT6對外界pH變化非常敏感[10]。隨著對K+通道的研究,尚有一些問題有待深入探討,比如亞基的功能、基因突變與疾病的不一致性等。由于K+通道自身的復雜性和多樣性使得對一些K+結構和功能的認識上存在一定的局限性。多學科交叉研究和先進的技術方法的使用,對于探討某些疾病或狀態的機制、早期診斷及發現特異性治療藥物或措施等均具有十分重要的理論和實際意義[11]。

利用生物信息學對蛋白進行序列分析,從而推斷并預測其結構和功能,已成為初步確定基因結構及功能的一種捷徑[12]。本文篩選了釀酒酵母、黃曲霉、煙曲霉、禾谷鐮刀菌、玉米黑粉菌、布拉克須霉等12種真菌的鉀離子通道蛋白,采用生物信息學分析了這些蛋白的理化性質、結構特征和系統進化等,以期為真菌鉀離子通道蛋白結構與生理功能研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

12種真菌釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、黃曲霉(Aspergillusflavus)、煙曲霉(A.fumigatus)、禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、玉米黑粉菌(A.flavus)、布拉克須霉(Phycomycesblakesleeanus)等。

NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)。

1.2 實驗方法

從NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中查找12種真菌鉀離子通道蛋白的氨基酸序列(表1)。

表1 12種真菌鉀離子通道氨基酸和核苷酸序列號Table 1 Amino acid and nucleotide sequence number of 12 fungal potassium channel proteins

利用ProtParam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分析核酸及氨基酸序列的組成成分及理化性質。采用CLCCombinedWorkbench6觀察圖形化的多重序列比對結果。采用WebLogo產生序列logo圖譜[13]。利用ClustalX1.83和MEGA6.0.5軟件對12種真菌鉀離子通道氨基酸和核苷酸序列構建系統進化樹[14]。利用NPS分析蛋白質的二級結構[15]。利用SWISS-MODEL分析蛋白質的三級結構[16]。

利用HOMCOS進行同源四聚體結構模擬。

1.3 系統進化樹的構建

應用多序列比對工具ClustalX1.83,以氨基酸全序列聯配的結果為基礎,用MEGA6.0.5軟件中的鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹,通過隨機逐步比較的方法搜索最佳系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 真菌鉀離子通道蛋白理化性質分析

利用ProtParam在線工具分析釀酒酵母、黃曲霉、煙曲霉、禾谷鐮刀菌、玉米黑粉菌、布拉克須霉等12種真菌鉀離子通道蛋白的核苷酸及其氨基酸序列。結果表明(見表2),氨基酸序列長度在659～928 aa之間,分子量在73970.53～101330.60 Da之間,理論等電點在5.45～9.54之間,亞細胞定位分析表明真菌鉀離子通道蛋白主要定位在質膜、液泡上。親水性/疏水性分析顯示疏水區域明顯大于親水區域,說明真菌鉀離子通道蛋白親水性較強,為親水性蛋白。蛋白磷酸化位點分析表明,不同真菌鉀離子通道蛋白具有3～18個絲氨酸位點,其中多數蛋白具有相對保守的3個絲氨酸位點。

表2 12種真菌鉀離子通道蛋白理化性質分析Table 2 Analysis of physical and chemical properties of 12 fungal potassium channel proteins

2.2 真菌鉀離子通道蛋白同源性比較

利用NCBI Blast程序對選取的12種不同真菌鉀離子通道蛋白序列進行同源性比對。結果表明,米曲霉菌鉀離子通道蛋白(XP_001821104.1)與黃曲霉菌(XP_002376854.1)的同源性最高達99.85%,與黑曲霉菌(XP_001393797.2)、煙曲霉菌(XP_752795.1)的同源性為59.37%,與擴展青霉(XP_016598289.1)的同源性為51.69%,與油菜莖基潰瘍病菌(XP_003842737.1)的同源性為38.13%,與灰葡萄孢菌(EMR91056.1)的同源性為36.43%,與禾谷鐮刀菌(XP_011328543.1)的同源性為27%,與釀酒酵母(CAA64176.1)的同源性為19.54%,與玉米曲霉菌(XP_001821104.1)的同源性為15.36%,與布拉克須霉(XP_018296227.1)的同源性為15.04%,與長雌異水霉(KNE72472.1)的同源性為13.59%。

采用CLC Combined Workbench 6觀察圖形化的多重序列比對結果(圖1),證實了上述同源性比對的結果。WebLogo基于多序列比對信息,把多序列的保守信息通過圖形表示出來。每個logo由一系列氨基酸組成,在每一個序列位置上用總高度表示此位置上的序列保守性,用氨基酸字母的高度表示出現的頻率[17]。分析表明不同真菌鉀離子通道蛋白具有特殊的鉀離子選擇器保守結構TXGYGD(圖2)。

圖1 12種真菌鉀離子通道蛋白氨基酸序列對比Fig.1 Alignment of potassium channel proteins amino acid sequences in 12 kinds of fungal

圖2 12種真菌鉀離子通道蛋白氨基酸序列Logo圖譜Fig.2 The sequence logos of potassium channel proteins in 12 kinds of fungal by Web Logo

2.3 真菌鉀離子通道蛋白系統進化樹分析

真菌鉀離子通道蛋白主要采用多序列比對工具ClustalX1.83和MEGA6.0.5軟件。是以氨基酸全序列聯配的結果為基礎,采用軟件中的MEGA6.0.5鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建系統發育樹。對上述12種真菌鉀離子通道蛋白氨基酸序列通過隨機逐步比較的方法，搜索最佳系統進化樹,對生成的系統樹進行Bootstrap校正。構建系統進化樹,采用默認參數。結果表明(圖3),分屬于擔子菌門、子囊菌門、結合菌門以及壺菌門的各類真菌鉀離子通道蛋白能夠分別聚類在一起。其中,米曲霉(A.oryzae,XP_001821104.1)和黃曲霉(A.flavus,XP_002376854.1)在同一個進化分支上,同源性最高,其次為黑曲霉,這與同源性比較的結果相一致。

圖3 12種真菌鉀離子通道蛋白系統進化分析Fig.3 The phylogenetic analysis of potassium channel proteins in 12 kinds of fungal

2.4 真菌鉀離子通道蛋白二級結構分析

蛋白質的二級結構是蛋白質分子的多肽鏈通常在一級結構的氨基酸折疊盤曲成比較穩定的,才能進一步完成具有蛋白質活性的三級或四級構象,以完成特定的生命活動。蛋白質的二級結構通常由α-螺旋、β-折疊、γ-轉角、延伸鏈及無規則卷曲等組件組成。真菌鉀離子通道蛋白二級結構主要是通過NPS程序對12種真菌鉀離子通道蛋白序列進行二級結構分析表明,真菌鉀離子通道蛋白均由α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲和延伸鏈等結構元件組成,其中螺旋所占比例最高,在40.92%～52.24%之間,其次為無規則卷曲或延伸鏈(表3)。在不同真菌鉀離子通道蛋白中,上述3種元件的比例和分布存在差異,例如,米曲霉的α-螺旋占 44.87%,延伸鏈占13.97%,無規則卷曲占41.16%,這暗示鉀離子通道蛋白在不同真菌中可能具有獨特的功能。

表3 12種真菌鉀離子通道蛋白二級結構分析Table 3 The secondary structure analysis of 12 fungal potassium channel proteins

2.5 真菌鉀離子通道蛋白三級結構分析

蛋白質的三級結構主要是指在二級結構的基礎之上,經過再一次的充分折疊形成一個球形、包裹緊密、已經具有生物活性的完整三維立體結構,即天然構想[18]。利用Swiss-Model采用同源建模的方法預測不同真菌鉀離子通道蛋白的三級結構。從圖4可以看出,三級結構主要是由螺旋、無規則卷曲和延伸鏈等二級結構元件組成,其空間結構高度相似,具有高度保守的結構特征,表明它們可能具有相似的生物學功能。鉀離子通道蛋白在活體膜中通常以四聚體結構存在,本文以黃曲霉菌鉀離子通道蛋白(XP_002376854.1)為例,利用HOMCOS進行同源四聚體結構模擬,結果發現其符合鉀離子通道結構特征,詳見圖5。不同真菌鉀離子通道蛋白單體的拓撲結構和聚角度也存在差異,表明每種真菌鉀離子通道蛋白可能具有自己獨特的功能。

圖4 12種真菌鉀離子通道蛋白的三級結構分析Fig.4 The tertiary structure analysis of potassium channel proteins in 12 kinds of fungal

圖5 黃曲霉菌鉀離子通道蛋白的三級結構分析Fig.5 The tertiary structure analysis of potassium channel proteins in A.flavus

3 結論

本研究選擇12種真菌鉀離子通道蛋白進行生物信息學分析。一般認為,蛋白質的一級結構決定二級結構,二級結構決定三級結構。蛋白質的生物學功能在很大程度上取決于其空間結構,蛋白質結構構象多樣性導致了不同的生物對環境適應性的不同。序列分析發現其都具有的保守結構域保守結構TXGYGD,屬于鉀離子通道鉀離子選擇器典型的特征片段。由二級結構分析表明,真菌鉀離子通道蛋白均主由螺旋、無規則卷曲和延伸鏈等結構元件組成,但不同真菌中不同元件的比例和分布存在差異,這暗示鉀離子通道蛋白在不同真菌中雖然具有相似的功能,但每種真菌的鉀離子通道蛋白可能具有自身獨特的功能。三維結構分析表明,黃曲霉菌鉀離子通道蛋白在活體膜中是以四聚體結構存在的,這一結構對于蛋白質的結構穩定和功能行使的正確性有重要作用。蛋白質磷酸化是最重要的蛋白質翻譯后修飾方式之一,可有效調控蛋白質活力和功能,并在細胞信號轉導過程中起重要作用。研究表明,磷酸化是真菌鉀離子通道蛋白活性調節的一種重要方式,很多真菌鉀離子通道蛋白在生物體內都會發生磷酸化,而本研究中的磷酸化位點分析表明主要分布在絲氨酸上,絲氨酸位點一般3～18個。多個磷酸化位點的存在可能在植物脅迫和亞細胞定位中起著重要作用,可增強真菌鉀離子通道蛋白調控途徑的多樣性。

然而關于真菌鉀離子通道的相關文獻較少,真菌孢子萌發過程中是否涉及到鉀離子通道更是尚無研究報道。通過解析真菌鉀離子通道的結構與功能,可以更加深入地了解其在真菌生長發育侵染等過程中的作用機制,為病原性真菌的防治提供新的思路。