紫皮洋蔥低聚糖的提取及分離研究

賈 甜,曾 潔,張瑞瑤,曹 蒙,宋孟迪,胡雅婕,高海燕，張 浩

(河南科技學院食品學院,河南新鄉 453003)

洋蔥,又名玉蔥,百合科蔥屬植物,被譽為“蔬中皇后”、“菜中玫瑰”。洋蔥營養豐富,含有硫化合物、低聚糖、類黃酮化合物、多糖、前列腺素類和甾體皂苷等多種生理活性物質,具有抗癌,抗菌,抗衰老,降血壓,抗動脈硬化,治療糖尿病等生理作用[1-2]。其中,洋蔥中含有豐富的低聚糖,低聚糖是由2～10個單糖通過糖苷鍵連接形成的直鏈或支鏈低度聚合糖[3],洋蔥低聚糖不僅具有低熱、穩定、安全無毒的理化性質,而且具有預防、抑制和殺死腫瘤細胞,提高機體免疫力,激活巨噬細胞的吞噬活性,提高機體的抗感染能力的重要作用[4-6]。目前多采用溶劑直接浸提、微波和超聲波輔助萃取及酶水解法提取低聚糖,但由于聚合度或極性相近,低聚糖的分離是一大難題。本文對紫皮洋蔥低聚糖的提取進行優化,并對提取物進行Bio gel P-2生物膠層析分離檢測及水解研究,為紫皮洋蔥低聚糖的進一步研究提供了理論依據,同時也為植物低聚糖的分離方法及水解方法提供一種參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮紫皮洋蔥 市售;蒽酮 天津市科密歐化學試劑有限公司;硫酸 鄭州派尼化學試劑廠;乙酸乙酯、甲醇、乙醇、葡萄糖(TLC檢測用) 天津市光復科技發展有限公司;果糖(TLC檢測用) 合肥博美生物科技有限責任公司;蔗糖(TLC檢測用) 天津市德恩化學試劑有限公司;棉子糖(TLC檢測用) Alfa Aesar;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市東麗區天大化學試劑廠;葡萄糖(HPLC分析用)、果糖(HPLC分析用)、蔗糖(HPLC分析用)蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果六糖 量子高科(中國)生物股份有限公司;β-D-呋喃果糖苷酶(酶活力為330 U/mg)、硅膠板(GF254) 美國sigma公司;生物膠Bio-gel P-2 美國BIO-RAD公司;4-甲氧基苯甲醛 國藥集團化學試劑有限公司。

WBL25B26型榨汁機 美的公司;ME104E型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHZ-95B型循環水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;SHA-C型水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司;冰箱 青島海爾股份有限公司;TDL-40B臺式離心機 上海安亭科學儀器廠;YRE-52AA型旋轉蒸發儀 鞏義市予華儀器有限責任公司;HZ-2S型恒流泵 上海瀘西分析儀器廠有限公司;玻璃點樣毛細管 華西醫科大學儀器廠;721型分光光度計 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;恒溫鼓風干燥箱 上海瑯玕實驗設備有限公司;FL-1型可調式封閉電爐 北京市永光明醫療儀器有限公司;10 μL微量進樣器 上海高鴿工貿有限公司;Waters 510型高效液相色譜儀 Waters公司(Milford,MA,USA)。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫皮洋蔥低聚糖的提取 將新鮮紫皮洋蔥剝去外層干皮,破碎其組織,得到勻漿液,準確稱取勻漿10 g置于250 mL燒杯中,量取100 mL 95%乙醇用于除去洋蔥勻漿中的可溶性單糖,抽濾,濾渣重復洗滌兩次,采用熱水浸提法,將一定料液比的濾渣和超純水裝入錐形瓶中,并加上封口膜,置于水浴振蕩器中,在一定提取溫度、一定提取時間條件下,得到紫皮洋蔥糖類物質,加2.5倍無水乙醇攪拌并置于4 ℃冰箱過夜,以4500×g轉速離心5 min,棄沉淀,將上清液旋轉蒸發即可得到紫皮洋蔥低聚糖提取液,定容至50 mL備用[2,7-9]。

1.2.2 低聚糖含量的定性分析 紫皮洋蔥低聚糖提取液經過蒽酮-硫酸比色法顯色后[13-15],采用紫外-可見光譜儀掃描顯色后的溶液[13],采集吸收波長為400～800 nm,分辨率為1 nm的吸收光譜。

采用蒽酮-硫酸比色法制作葡萄糖標準曲線[12]。

紫皮洋蔥低聚糖的測定:取1 mL紫皮洋蔥低聚糖提取液,采用蒽酮-硫酸比色法在紫外光譜最大波長處測定其吸光值,平行測定3次,取平均值,代入標準曲線,計算出低聚糖提取量,再根據以下公式計算得率。

得率(mg/g)=低聚糖提取量(mg)/紫皮洋蔥重量(g)

1.2.3 紫皮洋蔥低聚糖提取試驗設計

1.2.3.1 單因素實驗 在提取溫度為70 ℃、提取時間80 min的條件下,探究料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 g/mL對洋蔥低聚糖得率的影響;在料液比1∶3 g/mL,提取溫度70 ℃的條件下,探究提取時間60、70、80、90、100 min對洋蔥低聚糖得率的影響;在料液比為1∶3 g/mL,提取時間為80 min的條件下,探究溫度50、60、70、80、90 ℃對洋蔥低聚糖得率的影響。

1.2.3.2 正交試驗 為確定最佳提取工藝參數,采用L9(34)正交設計,比較料液比(A)、提取時間(B)和提取溫度(C)對洋蔥低聚糖得率的影響,以洋蔥低聚糖得率作為指標。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Experiment design

1.2.4 低聚糖的TLC檢測分析 TLC染色液:準確量取12.5 mL 4-甲氧基苯甲醛于212.5 mL冰浴甲醇中,攪拌,防止液體飛濺,小心加入25 mL濃硫酸于冰浴甲醇中,60 min內加完,淡黃色的染色液貯存于-20 ℃備用。根據點樣個數,將薄層層析板裁取適當大小,用鉛筆在距薄層板一端大約 1 cm處每隔適當距離畫點,同時在下方做好標記,然后用移液器分別吸取0.3 μL濃度為10 mmol/mL的葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖及0.3 μL樣品點于對應點上,放入45 ℃干燥箱中烘干。把點好樣的薄層板放進展開槽中展開,以V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)∶V(冰醋酸)=6∶2 ∶1∶0.2為展開劑進行展開,展開完畢后,進行染色,記下斑點位置[16-17]。

1.2.5 質譜分析 本實驗將提取到的紫皮洋蔥低聚糖進行LC-MS/MS分析得到質譜圖,根據質譜峰的位置及峰的強度對產物進行成分分析和結構分析,本實驗采用TQD LC/MS system(Waters,USA),配有真空脫氣系統,設置掃描范圍為150～1800 m/z,流動相為超純水[18-19],使用微量進樣器進樣,每次進樣10 μL。

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1.2.6 高效液相色譜分析(HPLC) 采用高效液相色譜法對所提取到的低聚糖及該低聚糖水解后的產物進行定性分析。

標準品配制:分別稱取葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果六糖10 mg,加超純水溶解并定容至10 mL,配制成1 mg/mL的單一標準品存于4 ℃冰箱備用,根據使用需求進行稀釋,配制成不同濃度的混合標準樣品,過0.22 μm濾膜待用。

樣品處理:稱取紫皮洋蔥低聚糖10 mg,加超純水定容至10 mL,過0.22 μm濾膜待用。紫皮洋蔥低聚糖的水解:將一定量的紫皮洋蔥低聚糖加入到pH為5.5濃度為 50 mmol/L的磷酸緩沖液中,配制成濃度為10%的糖液,取4 mL于55 ℃預熱10 min,加入等量β-呋喃果糖苷酶液調節pH至4.0,在轉速為200 r/min的55 ℃氣浴蒸蕩器中反應40 min后放入沸水浴15 min終止反應,過0.22 μm濾膜待用[20-22]。

參數設置:HPLC分析在Waters 510高效液相色譜儀(Milford,MA,USA)上進行;分離柱:Hypersil-NH2柱(4.6×250 mm;5 μm);流動相:水∶乙腈=32∶68;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進樣量:10 μL。

1.2.7 紫皮洋蔥低聚糖的分離純化 準確稱取20 g紫皮洋蔥勻漿,按優化后的方法提取紫皮洋蔥低聚糖,提取液經抽濾后濃縮至約2 mL,然后用Bio gel P-2凝膠層析柱純化[23-27]。將處理好的Bio gel P-2凝膠裝柱,上樣,洗脫劑為去離子水,調整自動收集器收集,每8 min收集1管,每管6 mL,利用重力作用洗脫平衡1～2個柱體積。對收集到的100管分離液進行TLC快速檢測,用微量移液槍依次吸取各管0.3 μL溶液,點樣,烘干,置于254 nm紫外燈下觀察是否有顯紫外的點,做好標記,然后對硅膠板進行染色,烘烤,挑選出不顯紫外且顯色點的管號做進一步TLC檢測分析,并以葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖為標準樣品作為參照。

從經快速檢測顯色的管中吸取1.0 mL分離液,以蒽酮-硫酸比色法在紫外光譜圖最大吸收峰處測定吸光值,處理數據,作紫皮洋蔥低聚糖提取液的糖分分布曲線。

1.3 數據統計分析

采用Excel 2007軟件、正交助手軟件及Origin 8.0軟件處理分析實驗數據并繪圖,每個樣品平行測定三次。

2 結果與分析

2.1 紫皮洋蔥低聚糖的可見光譜分析及標準曲線建立

紫皮洋蔥低聚糖的可見光譜圖如圖1所示。從圖1中可看出,在628 nm處有最大吸收峰,故選擇628 nm為吸收波長。標準曲線如圖2所示,實驗測得標準回歸方程為:y=0.0111x+0.0116,相關系數為:R2=0.9995。

圖1 紫皮洋蔥低聚糖的可見光譜分析Fig.1 Visible spectrum analysis of oligosaccharides from purple onion

2.2 單因素實驗

2.2.1 料液比的確定 由圖3可知,料液比在1∶1～1∶4 g/mL之間時,低聚糖提取量隨著水提取劑用量的增加不斷增加,這可能是由于提取劑用量的增大提高了原料與溶劑之間的傳質推動力[22],提高了糖分子的擴散速率,從而低聚糖不斷溶出。當料液比達到1∶4 g/mL,再增加提取劑的量時,低聚糖提取量沒有明顯增加,趨于穩定狀態,可能是在此條件下,低聚糖已經近乎全部浸出,再增加提取劑只會增加旋轉蒸發濃縮難度以及成本,所以,選擇料液比為1∶3、1∶4、1∶5三個水平為正交試驗考察因素。

圖3 料液比對低聚糖提取量的影響Fig.3 Effect of liquid ratio on the extraction of oligosaccharides

2.2.2 提取時間的確定 低聚糖的提取過程十分復雜,包括浸泡、擴散、滲透、溶解、再擴散、平衡等多個步驟[8]。由圖4可知,提取時間在50～90 min時,隨著時間的延長,低聚糖能不斷的溶出,提取量隨著時間的增加而增加。但是當提取時間大于90 min時,低聚糖提取量反而減小,提取時間過長,會造成提取液中部分寡糖分解,導致得率下降。所以,選擇提取時間為80、90、100 min三個水平為正交試驗考察因素。

圖4 提取時間對低聚糖提取量的影響Fig.4 Effect of extracting time on the extraction of oligosaccharides

2.2.3 提取溫度的確定 由圖5可知,溫度在50～70 ℃之間時,低聚糖提取量隨提取溫度的升高而增加,在此溫度范圍內,低聚糖溶解度隨著溫度的升高而增大。當溫度高于70 ℃后,溫度越高低聚糖提取量反而減少,這可能是某些熱穩定性較差的寡糖在較高溫度下分解,從而導致較低的提取量。所以,選擇溫度為60、70、80 ℃三個水平為正交試驗考察因素。

圖5 提取溫度對低聚糖提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction of oligosaccharides

2.3 正交試驗結果與分析

由表2可知,影響紫皮洋蔥低聚糖得率的主次因素是提取溫度>提取時間>料液比,由K值可知,紫皮洋蔥低聚糖提取條件的最佳組合為A3B1C2,即料液比1∶5 g/mL,提取時間80 min,提取溫度70 ℃,經驗證,所提取到的低聚糖得率為3.92 mg/g,其他條件下都高。

表2 正交試驗結果Table 2 The orthogonal experiment results

2.4 TLC檢測與質譜分析

由圖6可知,紫皮洋蔥提取液的TLC圖譜中顯示了主要的兩大類糖分,其中位置較高的斑點與果糖的Rf值相近,位置較低的斑點與蔗糖的Rf值相近,并且樣品點靠下部分有拖尾現象,可能是其它聚合度的糖類物質但其所占比例很低,難以清晰顯現。由圖7質譜圖及表3質譜分析表可知,所提取的紫皮洋蔥低聚糖中存在二糖(360.13 m/z)、三糖(521.95 m/z)、四糖(683.86 m/z)、六糖(1029.64 m/z),可能因為某些聚合度的糖含量較低,所以在TLC檢測中難以清晰顯現,其中測得的分子量中,1146.26、1302.27、1486.58 m/z為上述聚合度的低聚糖在質譜測量過程中不同聚合度的疊加,1146.26 m/z為三糖和四糖的疊加,1302.27 m/z為二糖和六糖的疊加或者是兩個四糖的疊加,1486.58 m/z為三個三糖的疊加。關于低聚糖組分的定性分析及其活性評價,將在后續實驗中進一步研究,以確定其單糖組分與活性的關系。

圖6 紫皮洋蔥低聚糖的TLC圖譜Fig.6 TLC analysis of carbohydrates from purple onion

圖7 紫皮洋蔥低聚糖的質譜圖Fig.7 MS of oligosaccharides from purple onion

表3 紫皮洋蔥低聚糖質譜分析表Table 3 The MS analysisTable of oligosaccharides from purple onion

2.5 HPLC結果分析

由圖8、圖9可知,紫皮洋蔥低聚糖中含有蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果六糖,其中,蔗果三糖含量較高,蔗果四糖,蔗果六糖含量相對較低,同時,發現葡萄糖和果糖含量較低,說明乙醇沉淀法能較好的除去單糖。由圖10可知,紫皮洋蔥低聚糖經β-呋喃果糖苷酶水解后,蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果六糖含量明顯降低,果糖和葡萄糖含量升高,該水解后的HPLC分析說明β-呋喃果糖苷酶在適宜條件能較好的水解紫皮洋蔥低聚糖中的蔗果低聚糖。

圖8 混合標準溶液的HPLC分析Fig.8 HPLC analysis of the mixed standard solution注:1:果糖;2:葡萄糖;3:蔗糖;4:蔗果三糖; 5:蔗果四糖;6:蔗果六糖；圖9、圖10同。

圖9 紫皮洋蔥低聚糖的HPLC分析Fig.9 HPLC analysis of oligosaccharides from purple onion

圖10 紫皮洋蔥低聚糖水解后的HPLC分析Fig.10 HPLC analysis of oligosaccharides after hydrolysis from purple onion

2.6 Big gel p-2分離純化

由圖11可知,經Big gel p-2凝膠柱層析后,所收集的分離樣品中53～71管均有糖類物質存在,53～63管有和蔗糖Rf值相近的糖類物質存在,61～69管有和果糖Rf值相近的糖類物質存在,而粗樣品中的拖尾點可能是濃度較低的低聚糖點,經分離后濃度太低,在薄層層析板上未能清晰顯現。由圖12為紫皮洋蔥低聚糖經Big gel p-2凝膠柱層析后得到的糖分分布曲線,Big gel p-2凝膠能起到將具有一定特點的糖類聚集分離的作用,但是并不能完全將洋蔥中單一聚合度的低聚糖分離。

圖11 紫皮洋蔥低聚糖分離后的TLC檢測注：1:葡萄糖;2:果糖;3:蔗糖;4:棉子糖; 5:樣品;6～14:53管～69管中單數管。Fig.11 TLC analysis of carbohydrates from purple onion after separation

圖12 紫皮洋蔥低聚糖洗脫曲線Fig.12 Elution curve of carbohydrates from purple onion

3 結論

采用熱水浸提法對新鮮紫皮洋蔥進行低聚糖的提取,通過單因素實驗及正交試驗確定影響紫皮洋蔥低聚糖提取量的主次因素是提取溫度>提取時間>料液比,最佳提取工藝為料液比1∶5 (g/mL)、提取溫度70 ℃、提取時間80 min,在此提取工藝下,所提取到的低聚糖含量為3.92 mg/g。TLC檢測和MS分析對粗寡糖進行檢測,研究表明,所提取的紫皮洋蔥低聚糖中存在二糖、三糖、四糖、六糖。同時,對粗寡糖及其水解產物進行HPLC分析,結果顯示,紫皮洋蔥低聚糖主要組成為蔗果低聚糖,在適宜條件下,β-呋喃果糖苷酶能較好的對其水解。粗寡糖經Bio gel P-2凝膠柱層析后,雖然不能將紫皮洋蔥低聚糖不同聚合度的糖組分完全分開,但能對其進行初步分離。