響應面優化銅藻(Sargassum horneri)中 褐藻多酚的提取及其結構鑒定

王育信,田曉清,李驕洋,屠璐丹,譚淑云,吳文惠,3,包 斌,3,*

(1.上海海洋大學食品學院,上海 201306; 2.中國水產科學研究院東海水產研究所,上海 200090; 3.上海海洋大學食品科學與工程國家級實驗教學示范中心,上海 201306)

銅藻(Sargassumhorneri)俗稱 “丁香屋”,屬褐藻綱墨角藻目馬尾藻科馬尾藻屬,是一種經濟型大型褐藻[1]。銅藻主要分布于遼寧、浙江、福建和廣東等沿海地區,在醫藥、食品、飼料中有較高的應用價值[2]。據《中華本草》和《廣東中藥志》記載,銅藻可用于治療水腫、咳嗽、甲狀腺腫大等疾病。除多糖、蛋白質、礦物質和脂類等營養成分外,銅藻中還含有萜類化合物、褐藻多酚等活性物質[3]。其中褐藻多酚(Phlorotannins)是一類間苯三酚(Phloroglucinol)的聚合物,主要存在于褐藻中,是細胞壁的結構成分。迄今為止已被鑒定的褐藻多酚有近百種。褐藻多酚具有多種活性,如抗氧化性、抗菌性、抗病毒性、抗炎癥、抗腫瘤性、抗凝血性、抗糖尿病綜合癥和保護肝臟等活性[4-10]。因此從褐藻中提取得到褐藻多酚作為一種天然活性成分,具有成為新型藥物和健康產品的巨大潛力[11]。有學者采用70%的乙醇溶液直接抽提后,分析銅藻多酚提取物中總酚含量[12];盧虹玉等[13]在室溫條件下采用80%的甲醇溶液直接提取全緣馬尾藻干粉,分別分析了水相萃取物和乙酸乙酯相萃取物中總酚含量;Sugiura等[9]在5 ℃下采用甲醇直接提取48 h,分別分析了昆布多酚粗提物和昆布乙酸乙酯萃取物中的總酚含量,而從銅藻中提取并分析褐藻多酚還未見報道。

本文采用超聲輔助提取法,以褐藻多酚得率為指標,結合單因素實驗分析法分析乙醇體積分數、液固比、超聲提取時間三個因素,并通過響應面分析得出褐藻多酚最佳提取條件,并采取液相色譜儀聯用四級桿串聯飛行時間質譜儀(LC-TOF-MS)對分離萃取后的樣品中褐藻多酚進行了初步分析鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銅藻(Sargassumhorneri) 由上海海洋大學水產與生命學院提供;薄層層析硅膠 粒度200～300目,青島海洋化工廠分廠;間苯三酚、2,4-二甲氧基苯甲醛 光譜純,均購于國藥集團化學試劑公司;無水碳酸鈉、Folin-Ciocalteu試劑、無水乙醇、乙酸乙酯、冰醋酸、鹽酸 分析純,均購于國藥集團化學試劑公司;水 蒸餾水。

SH-1000 Lab酶標儀 CORONA;ATX224型電子天平 日本島津公司;1290LC-6224型LC-TOF-MS 安捷倫科技有限公司;CR-21G型冷凍高速離心機 株式會社日立制作所;DZF-6030型真空干燥箱 上海新苗醫療器械制造有限公司;DHG-9070A型鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司;SB4200DT型超聲清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 將新鮮銅藻用清水洗滌,去除雜質沙泥,紗布濾干后55 ℃烘干,研磨過120目篩,細粉置陰涼干燥處備用。

1.2.2 單因素實驗設計 對影響褐藻多酚超聲提取的乙醇體積分數、液固比以及超聲提取時間進行單因素試驗,超聲功率為400 W。精確稱取銅藻干粉1 g,在液固比為30∶1 mL/g,超聲提取時間75 min的條件下,探討不同乙醇體積分數(0%、20%、40%、60%、80%、95%)對銅藻中褐藻多酚得率的影響;在乙醇體積分數為60%,超聲提取時間75 min,探討液固比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g)對銅藻褐藻多酚得率的影響;在乙醇體積分數為60%,液固比為40∶1 mL/g,探討超聲提取時間(15、30、45、60、75 min)對銅藻褐藻多酚得率的影響;收集殘渣并反復提取3次,旋轉蒸發后定容至50 mL。

1.2.3 褐藻多酚的響應面試驗 根據單因素分析結果,響應面試驗采用銅藻干粉1 g;選用乙醇體積分數、液固比以及超聲提取時間作為試驗因素,以褐藻多酚得率作為響應面值,設計三因素三水平17個試驗點5個中心點的響應面優化試驗,響應面因素間水平設計見表1。

表1 響應面分析因素及水平Table 1 Analytical factors and levels for response surface methodology

1.2.4 褐藻多酚得率的測定(DMBA法) 參照文獻[14-16]方法略有改動。配制濃度為0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.15 mg/mL的間苯三酚標準溶液。吸取50 μL樣品與標準溶液于96孔板中,加入125 μL的6%鹽酸冰醋酸溶液,5 min后樣品及標準曲線加入125 μL的2% 2,4-二甲氧基苯甲醛冰醋酸溶液,樣品空白加入125 μL的冰醋酸。放置1 h,在520 nm處測吸光度。根據標準曲線(y=18.805x+0.0031,R2=0.9999)得到褐藻多酚得率(mg/mL)并計算得率。

褐藻多酚得率的計算公式如下:

式中:M1:褐藻多酚的含量(mg);m0:銅藻干粉的質量(g)。

1.2.5 總酚的測定 參照Folin-Ciocalteu法[17],配制為0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL 的間苯三酚標準溶液。吸取20 μL樣品于標準溶液于96孔板中,樣品及標準溶液加入100 μL的Folin-Ciocalteu試劑,混勻8 min后加入7.5%的碳酸鈉溶液。樣品空白加入180 μL的蒸餾水。蒸餾水200 μL為校準。避光放置2 h后,在730 nm 處測吸光度。根據標準曲線(y=0.0059x+0.0057,R2=0.9995)得到總酚得率(g/mL)并計算得率。

總酚得率的計算公式如下:

式中:M2:總酚的含量(g);m1:銅藻干粉的質量(g)。

1.2.6 褐藻多酚與總酚的相關性分析 運用SPSS軟件以褐藻多酚得率為橫坐標,總酚得率為縱坐標,分析褐藻多酚得率與總酚得率的關系。

1.2.7 銅藻多酚提取物的分離純化 參考Sugiura等[9]的方法略有改動。在最優提取條件下,用乙醇溶液提取銅藻干粉,經旋轉蒸發得到銅藻乙醇提取液,用乙酸乙酯以體積比1∶1的比例萃取銅藻乙醇提取液七次,得到銅藻乙酸乙酯萃取液,旋轉蒸發至干物,得到乙酸乙酯餾分,過硅膠柱(3.0 cm×250 cm)分離。流動相:二氯甲烷∶甲醇200∶1～6∶4,得到25個餾分,用DMBA法測定褐藻多酚得率,合并含有褐藻多酚的餾分。真空干燥后溶于甲醇,配制4 mg/mL的溶液,過C18預處理柱,待LC-TOF-MS鑒定。

1.2.8 LC-TOF-MS條件

1.2.8.1 色譜條件 參照Ferreres等[18]方法略有改動。色譜柱:YMC-Pack ODS-AQ C18(75×4.6 mm,3 μm);柱溫20 ℃。流動相:以0.1%甲酸甲醇為A相,0. 1%甲酸乙腈為B相;程序洗脫:0 min,0% B;5 min,0% B;15 min,30% B;17.5 min,80% B;20 min,80% B;22.5 min,0% B;保持3.5 min;26 min。流速:0.3 mL/min,進樣量5 μL,進樣溫度4 ℃;DAD波長掃描范圍200～400 nm;紫外檢測波長280 nm。

1.2.8.2 質譜條件 干燥氣氮氣流速8.0 L/min;干燥氣溫度350 ℃;霧化氣壓力40 psig;裂解電壓175 V;毛細管電壓4000 V;質譜掃描范圍:m/z 100～1800。

質量校正:參比溶液通過參比Nebulizer與樣本同時導入離子源進行實時參比,正離子模式下選擇離子322.048132、622.028960和922.009798。

1.3 數據統計分析

本實驗所有樣品均為三次平行。本文作圖采用OriginPro 8.0軟件,響應面分析采用Design-Expert 8.0.6 Trail軟件;利用SPSS statistic 19進行顯著性分析以及相關性分析,利用Qualitative Analysis B.04.00對LC-TOF-MS 的結果進行分析。

2 結果與討論

2.1 褐藻多酚得率的單因素試驗

2.1.1 乙醇體積分數對褐藻多酚得率的影響 由圖1可知,銅藻中褐藻多酚得率隨乙醇體積分數增大呈先升高而后降低的趨勢。在0%～60%之間,褐藻多酚提取得率隨乙醇體積分數增大而增大,而乙醇體積分數大于60%時,褐藻多酚得率隨乙醇體積分數變大而降低。即在提取試劑乙醇的體積分數在60%能達到峰值。這是由于乙醇中的水能夠促進銅藻中的許多黏性物質和外來水分互溶形成膠團從而影響褐藻多酚得率,而體積分數過大的乙醇揮發性較大,使提取液極性降低也會影響褐藻多酚得率[19]。因此,乙醇體積分數選擇60%較為適宜。

圖1 乙醇體積分數對褐藻多酚得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on extraction yield of phlorotannins注:圖中不同小寫字母表示顯著性差異(p<0.05),圖2～4同。

2.1.2 液固比對提取褐藻多酚的影響 從圖2可知,隨著液固比的增加,褐藻多酚得率顯著提高,達到40∶1 mL/g后,逐漸趨于平穩。再增加液固比,提取率未增加,而且由于乙醇用量增加,成本增加,且不利回收。因此選擇液固比為40∶1 mL/g。

圖2 液固比對褐藻多酚得率的影響Fig.2 Effect of liquid-solid ratio on extraction yield of phlorotannins

2.1.3 超聲提取時間對提取褐藻多酚的影響 由圖3可見,當乙醇體積分數和液固比一定時,超聲提取時間在45 min時褐藻多酚得率最高,而后緩慢下降。這可能是因為提取時間過長,褐藻多酚會被氧化或降解[19]。所以超聲時間過長不利于褐藻多酚的提取,45 min較為適宜。

圖3 超聲時間對褐藻多酚得率的影響Fig.3 Effect of extraction time on extraction yield of phlorotannins

2.2 褐藻多酚得率的響應面分析

2.2.1 響應面分析 根據單因素褐藻多酚得率的結果,以提高褐藻多酚得率為目的,考察乙醇體積分數、液固比和超聲提取時間對銅藻中褐藻多酚得率的影響,分析結果見表2。

2.2.2 回歸模型的建立與方差分析 利用Design-Expert軟件對表2數據進行二次回歸擬合,得到褐藻多酚得率對乙醇體積分數、液料比和超聲提取時間的回歸模型:

表2 Box-behnken超聲波輔助提取褐藻多酚試驗Table 2 Box-behnken design, ultrasonic-assisted extraction of phlorotannins experiment

Y=-43.17629+1.07518×A+1.68151×B+0.13134×C-4.66425×10-3×A×B+1.02663×10-3×A×C+5.93667×10-4×B×C-8.59142×10-3×A2-0.017472×B2-1.82157×10-3×C2

如表3方差分析所示,超聲波輔助提取褐藻多酚得率試驗模型非常顯著(p<0.0001),表示回歸模型指標高度顯著;R2=0.9768,失擬誤差不顯著(p>0.05),說明該模型擬合程度良好。信噪比為17.628,遠遠大于臨界值4,說明該模型與實際值擬合度良好。

表3 超聲波輔助提取的方差分析Table 3 Analysis of variance for regression model regarding ultrasound-assisted extraction

回歸方程的各項顯著性表明:一次項A(p<0.0001)、C(p<0.01),交互項AB(p<0.05)對銅藻褐藻多酚得率影響顯著;二次項A2(p<0.0001)、B2(p<0.01)、C2(p<0.01)對銅藻中褐藻多酚得率影響極顯著。方差分析表中的F值及p值可知,影響褐藻多酚得率的主次順序依次為乙醇體積分數、超聲提取時間、液固比,乙醇體積分數和超聲提取時間對響應值影響比較大。

2.2.3 超聲輔助提取響應面的分析及優化 圖4～6反映了所考察的三個因素(乙醇體積分數、液固比和超聲提取時間)任意因素取零水平時,其他兩因素交互作用對褐藻多酚得率的影響程度。圖4曲面陡峭,說明乙醇體積分數和液固比交互作用顯著,乙醇體積分數對得率的影響較大,最初隨液固比的增加,褐藻多酚得率迅速增大,之后隨液固比的增加反而有開始下降;圖5可知,乙醇體積分數和超聲提取時間交互作用不顯著,褐藻多酚得率隨著乙醇體積分數的增大和超聲提取時間的延長均出現先增大后減小的趨勢;圖6可知,液固比和超聲提取時間交互作用不顯著,褐藻多酚得率隨著液固比的增大和超聲提取時間的延長均出現先增大后減小的趨勢。

圖4 乙醇體積分數與液固比對褐藻多酚 得率影響的等高線圖(a)和響應面圖(b)Fig.4 Response contour plots(a)and the surface diagram(b)of ethanol concentration and liquid-solid ratio impacting on extraction yield of phlorotannins

圖6 液固比與提取時間對褐藻多酚得率影響的 響應面圖(a)和等高線圖(b)Fig.6 Response contour plots(a)and the surface diagram(b)of solid-liquid ratio and extraction time impacting on extraction yield of phlorotannins

通過響應面分析,得到超聲波輔助提取銅藻中的褐藻多酚的最佳工藝條件是:乙醇體積分數為 54.72%，液固比為41.80∶1 mL/g，提取時間為58.3 min。在此工藝條件下,褐藻多酚得率的理論預測值為25.21 mg/100 g。為了便于試驗操作,最優條件簡化為:乙醇體積分數55%、液固比42∶1 mL/g、提取時間58 min。在最優條件下,通過實驗進行驗證,得到褐藻多酚的得率為(25.16±0.34) mg/100 g。與預測值相比,比較誤差在0.20%。表明實驗所得回歸方程的最大預測值與驗證值非常接近,說明回歸方程能較真實地反映各篩選因素的影響,建立的模型與實際情況比較吻合。

2.3 褐藻多酚得率與總酚得率的相關性分析

采用SPSS 19.0對單因素中45個樣品所得總酚得率和褐藻多酚得率進行雙變量相關性分析(如圖7),其相關系數為0.803,p<0.0001,非常顯著。即在銅藻多酚提取物中,隨著總酚的增加,褐藻多酚也相應增加,可以確定DMBA法測得的褐藻多酚與Folin-Ciocalteu法測得的總酚之間呈正相關。Folin-Ciocalteu法的原理為酚類物質在堿性條件下與磷鉬酸鹽發生氧化還原反應生成藍色混合物,樣品中所有羥基苯基團均發生此反應,不具有特異性,因此該方法用于總酚的測定。DMBA法的原理是酚類物質與醛發生顯色反應,是1,3-羥基苯基團和1,3,5-羥基苯基團發生的特異性反應,因此可用于褐藻多酚的測定。由于褐藻多酚是總酚的一部分,因此兩者呈正相關關系,在絕大多數情況下總酚得率可以反映褐藻多酚的得率。但是對于以鄰位羥基酚為主的樣品,若采用Folin-Ciocalteu法所得結果代表樣品中的褐藻多酚得率,會導致結果偏高,而采用DMBA法才能更準確分析樣品中褐藻多酚的得率。

圖7 褐藻多酚得率與總酚得率的相關性分析結果Fig.7 Correlation analysis results between phlorotannins and total phenol

2.4 LC-TOF-MS鑒定提取物中褐藻多酚的結構

利用LC-TOF-MS,在合并的餾分中鑒定出1個化合物(如圖8),該化合物在保留時間為14.8 min正離子模式下分子離子峰為m/z 375[M+H]+,其平均分子量為374.3036,理論值為374.2984,分子式為C18H14O9。分子離子經電噴霧離子化裂解為 m/z為357和232的碎片峰,其中脫去水后形成特征碎片m/z 357[M+H—H2O]+,脫去間苯三酚及羥基氧形成離子碎片m/z 232[M+H—O-C6H6O3]+。由此結果可知此化合物為C-O-C氧化酚連接起來的間苯三酚三聚體[20]。酚類物質在波長在280 nm下具有紫外吸收[21],該餾分在280 nm下的紫外吸收色譜圖中保留時間為14.8 min處有可見吸收,進一步佐證了該化合物的結構。

圖8 m/z為375的離子流色譜圖和波長為 280 nm下的紫外吸收色譜圖Fig.8 EICFigure of m/z=375 and UV absorption spectra at wavelength 280 nm

迄今發現分子量為374.3036的褐藻多酚有6個,分別是:Fucophlorethol-A、Fucophlorethol-B、Fucophlorethol-C、Triphlorethol A、Triphlorethol C、Trifucol。其中前五種褐藻多酚的結構中有C-O-C氧化酚連接。Fucophlorethol-A、Fucophlorethol-B、Fucophlorethol-C、Triphlorethol C分別從墨角藻(Fucusvesiculosus)[22]、褐藻(Laminaraiaochroleuca)[23]和Eiseniabicyclis[24]、Colpomeniabullosa[25]、Laminariaochroleuca[23]中被發現。Triphlorethol A是一種常見的三聚體,廣泛地存在于Cystophoraretroflexa[26]、昆布Eckloniastolonifera[27]、馬尾藻(Sargassumspinuligerum)[28]和昆布Eckloniacava[29]。銅藻是馬尾藻屬,初步推測該化合物是Triphlorethol A(如圖9)。

圖9 Triphloretol A的結構式Fig.9 The structural formula of Triphloretol A

3 結論

用超聲波輔助法提取銅藻中的褐藻多酚得率的最佳工藝條件為:乙醇體積分數為55%,液固比為42∶1 mL/g,提取超聲時間為58 min。在此條件下,褐藻多酚得率實際值為(25.16±0.34) mg/100 g。對于所得到的銅藻多酚提取物,Folin-Ciocalteu法測得的總酚得率與DMBA法測得的褐藻多酚得率呈正相關性。通過LC-TOF-MS鑒定出一種間苯三酚三聚體,推測該化合物為Triphlorethol A。