熒光PCR熔解曲線法檢測結核分枝桿菌 耐藥基因的結果分析

劉艷 古麗比克·木拉提 瑪力亞木·阿布力提甫 易星 李君蓮 師永歡 劉天劍

結核病是全球重大傳染病之一，嚴重威脅人類健康[1]。而耐多藥結核病(multidrug-resistant tuberculosis, MDR-TB)的產生，使結核病防治形勢更加嚴峻[2]。MDR-TB即至少同時對異煙肼(INH)和利福平(RFP)產生耐藥的結核病[3]，其治療成本高、周期長、治愈率低，早診斷、早治療是實現耐藥結核病有效防控的關鍵所在[4-6]。目前，常用的結核分枝桿菌藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)普遍存在耗時長、操作復雜、標準難以統一等缺點；因此，無論臨床還是疾控領域都迫切需要一種快速而準確的結核分枝桿菌耐藥檢測方法[4-8]。本研究應用探針熒光PCR熔解曲線法進行結核分枝桿菌DNA鑒定和INH、RFP耐藥突變的快速檢測，并與傳統的BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)液體培養和液體藥敏試驗結果相比較，以評價該方法在快速診斷結核病和MDR-TB中的應用價值，并為相關研究提供理論基礎。

材料和方法

一、 標本來源

收集2015年9月至2016年12月新疆維吾爾自治區胸科醫院976例疑似結核病住院患者的痰液標本。

二、 試劑與儀器

RFP、INH購于美國Sigma-Aldrich公司； MGIT 960液體培養設備及培養管購于美國BD公司；4% NaOH由購于國藥集團的分析純氫氧化鈉粉末以雙蒸水自行配制；Lab-Aid 824全自動核酸提取儀及配套結核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑購于廈門致善生物科技股份有限公司；Bio-Rad CFX96實時熒光PCR儀購于美國伯樂公司。

三、 液體培養與藥敏試驗

按照中國防癆協會《結核病診斷實驗室檢驗規程》進行MGIT 960液體培養(以下簡稱：液體培養)。用移液槍吸取2～5 ml痰液至50 ml離心管中，加入1～2倍體積的4% NaOH溶液，振蕩15～30 s，直至痰標本充分液化；隨后加入磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)至離心管45 ml標記處，顛倒離心管，充分混勻， 在8～10 ℃條件下， 3000×g離心15 min，棄去上清，加入無菌磷酸鹽緩沖液(pH值為6.8)至終體積為2.5 ml，重懸沉淀，吸取0.5 ml懸浮液于BBL MGIT 960培養管中，擰緊管蓋并充分混勻；最后將MGIT 960培養管放入儀器內進行孵育， MGIT 960熒光強度記憶探測器每隔60 min連續測定培養管內的熒光強度，判斷管內分枝桿菌的生長情況。若出現陽性標本，儀器紅色指示燈立即閃亮，同時有報警提示音。按儀器操作步驟取出陽性培養管并自動打印出結果。

培養結果陽性者將其培養物采用MGIT 960進行 RFP、INH液體藥敏試驗。在MGIT 960系統報告陽性之后的5 d之內必須完成藥敏試驗接種，先將3管BBL MGIT 960培養管分別標記為RFP、INH和GC(空白對照)，并加入0.8 ml配套的增菌劑；將100 μl RFP(83 μg/ml)或INH(8.3 μg/ml)加入對應的培養管中，取0.1 ml菌懸液用滅菌生理鹽水按照1∶100進行稀釋，吸取0.5 ml于GC培養管中，同時吸取0.5 ml未稀釋的菌懸液于RFP和INH培養管中，蓋緊管蓋，上下顛倒3～4次，將培養管放入MGIT 960培養儀中進行培養，根據分枝桿菌的生長情況對比而判斷該藥物的敏感性。

四、 熒光PCR熔解曲線法檢測RFP、INH耐藥突變

采用結核分枝桿菌利福平耐藥突變檢測試劑盒和結核分枝桿菌異煙肼耐藥突變檢測試劑盒進行檢測。利福平耐藥突變檢測試劑盒檢測結核分枝桿菌復合群rpoB基因507～533共27個氨基酸密碼子區域內(81 bp，利福平耐藥決定區)的突變情況；異煙肼耐藥突變檢測試劑盒檢測ahpC啟動子(-44至-30及-15～3位點)、inhA94密碼子、inhA啟動子區(-17至-8位點)，以及katG315密碼子的突變情況，以進行耐藥篩選。

樣本處理及提取：痰液樣本DNA提取前需進行液化，將痰液標本加到50 ml帶螺旋蓋子的試管中，加入2倍體積的4% NaOH溶液，擰緊螺旋蓋并振蕩混勻30 s，然后室溫放置15 min，期間震蕩數次，以保證痰液能完全液化。液化后采用Lab-Aid 824結核分枝桿菌核酸提取Maxi試劑進行提取。

PCR反應程序設置：(1)利福平程序。 UNG酶處理：50 ℃，2 min，1個循環；預變性：95 ℃ 10 min，1個循環；降落PCR循環：95 ℃ 15 s，70 ℃ 20 s(每個循環下降1 ℃)，76 ℃ 25 s，13個循環； PCR循環：95 ℃ 15 s，57 ℃ 20 s，76 ℃ 25 s，42個循環；熔解分析： 95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，45～85 ℃(設置在此階段每1 ℃采集FAM 和TET 通道熒光信號)，1個循環。(2)異煙肼程序。UNG處理：50 ℃ 2 min，1個循環；預變性：95 ℃ 10 min，1個循環；降落PCR循環：95 ℃ 10 s，71 ℃ 25 s(每個循環下降1 ℃)，75 ℃ 30 s，10個循環； PCR循環： 95 ℃ 10 s，61 ℃ 25 s，75 ℃ 25 s，45個循環；熔解分析： 95 ℃ 2 min，40 ℃ 2 min，40～80 ℃(設置在此階段每1 ℃采集FAM 和TET 通道熒光信號)，1個循環。

每個標本有2個反應管，同時檢測 FAM和TET熒光通道信號。根據說明書進行結果判讀：當標本在4個熒光通道的熔解溫度(Tm值)均與陽性對照的Tm值一致(誤差不超過 ±1 ℃) 時判定為野生型，此時對利福平或異煙肼敏感； 當4 個通道任一通道中標本的Tm值低于陽性對照 2 ℃及以上時(△Tm≥ 2 ℃) 判定為突變型，此時該樣本對利福平或異煙肼耐藥。

五、 統計學處理

采用SPSS 18.0軟件對數據進行統計學分析，試驗結果間的比較采用敏感度、特異度、符合率、Kappa值(較差：0.00～0.40；中等：0.41～0.60；較高：0.61～0.80；極好：0.81～1.00)等表示，以評價熒光PCR熔解曲線法的診斷應用價值。

結 果

一、診斷效能比較

本研究共收集痰標本976份，熒光PCR熔解曲線法對結核分枝桿菌DNA鑒定結果顯示有184份標本檢測結果為陽性，792份標本為陰性。MGIT 960液體培養結果顯示169份標本為陽性，807份標本為陰性；采用對硝基苯甲酸(PNB)進行菌種鑒定，液體培養陽性的標本中有11例為NTM，因此，最終確認為培養陽性的結核分枝桿菌標本為158例，陰性樣本有818例。兩種檢測方法共同檢測結果為陽性的標本有135份，共同檢測為陰性的標本為792份。以液體培養結果為標準，熒光PCR熔解曲線法檢測結核分枝桿菌的敏感度為85.44%，特異度為94.01%，Kappa值為0.75，符合率為92.62%，陽性預測值為73.37%，陰性預測值為97.10%，具體見表1。

二、異煙肼耐藥檢測結果

熒光PCR熔解曲線法和液體培養法均檢測為結核分枝桿菌陽性的135份標本中，經MGIT 960藥敏試驗檢測發現有24份標本對異煙肼耐藥，熒光PCR熔解曲線法耐藥突變檢測結果顯示26份標本對異煙肼耐藥。以MGIT 960藥敏試驗結果為標準，熒光PCR熔解曲線法檢測異煙肼是否耐藥的敏感度為83.33%，特異度為94.59%，符合率為92.59%，Kappa值為0.76，陽性預測值為76.92%，陰性預測值為96.33%，具體見表2。

三、利福平耐藥檢測結果

熒光PCR熔解曲線法和液體培養法共同檢測結核分枝桿菌陽性的135份標本中，經MGIT 960藥敏試驗檢測發現有24份標本對利福平耐藥，熒光PCR熔解曲線法耐藥突變檢測結果顯示28份標本對利福平耐藥。以藥敏試驗結果為標準，熒光PCR熔解曲線法檢測利福平耐藥的敏感度為95.83%，特異度為95.50%，符合率為95.56%，Kappa值為0.86，陽性預測值為82.14%，陰性預測值為99.07%，具體見表3。

表1 976份痰標本熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960液體培養檢測結果

注敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%=d/(b+d)×100%；符合率=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+真陰性數+假陽性數+假陰性數)=(a+d)/(a+b+c+d)；陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%=a/(a+b)×100%；陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%=d/(c+d)×100%

表2 135份痰標本熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960藥敏試驗異煙肼耐藥檢測結果

注敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%=d/(b+d)×100%；符合率=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+真陰性數+假陽性數+假陰性數)=(a+d)/(a+b+c+d)；陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%=a/(a+b)×100%；陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%=d/(c+d)×100%

表3 135份痰標本熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960藥敏試驗利福平耐藥檢測結果

注敏感度=真陽性數/(真陽性數+假陰性數)×100%=a/(a+c)×100%；特異度=真陰性數/(真陰性數+假陽性數)×100%=d/(b+d)×100%；符合率=(真陽性數+真陰性數)/(真陽性數+真陰性數+假陽性數+假陰性數)=(a+d)/(a+b+c+d)；陽性預測值=真陽性數/(真陽性數+假陽性數)×100%=a/(a+b)×100%；陰性預測值=真陰性數/(真陰性數+假陰性數)×100%=d/(c+d)×100%

討 論

據WHO報道，我國是耐藥結核病高負擔國家之一[3]，由于人口流動性增大和艾滋病流行趨勢的上升，其防治形勢更加嚴峻。而目前傳統的結核病診斷和耐藥檢測方法已經無法滿足耐藥結核病早發現、早治療的迫切需求。隨著分子生物學技術的發展，發現產生結核分枝桿菌耐藥的分子機制與基因突變有關，不同的基因突變使得結核分枝桿菌產生不同的藥物耐受性[9]。目前分子水平上的診斷方法主要有線性探針反向雜交法、基因芯片法、實時熒光PCR法和熒光PCR熔解曲線法等，為輔助診斷起到積極的促進作用[7,10-12]。熒光PCR熔解曲線法將聚合酶鏈式反應(PCR)和熒光探針熔解曲線分析法相結合，具有快速、準確、簡便、高效、經濟等優點，可同時對結核分枝桿菌利福平和異煙肼相關耐藥突變基因進行快速檢測，特別適用于臨床上大批量樣本篩查。

本研究顯示，與MGIT 960液體培養結果相比，熒光PCR熔解曲線法檢測結核分枝桿菌的敏感度及特異度較好，熒光PCR熔解曲線法總體檢出的陽性率較高。一方面可能因為MGIT 960液體培養時僅限于檢測標本中的活菌；而熒光PCR熔解曲線法因檢測的是結核分枝桿菌的基因組DNA，因此，即使結核分枝桿菌已經死亡，也可獲得陽性檢測結果。另一方面也可能與實驗人員的操作規范性、交叉污染等問題有關[13-14]。不同研究顯示，采用分子生物方法對痰液中的結核分枝桿菌進行檢測，相對于培養法其特異度多數為90%以上，敏感度為66.4%～100%，多數在90%左右[15-18]。與本次研究相近，細微的差別可能與入組的樣本、培養方法、樣本數量等因素有關。

在對異煙肼的耐藥突變檢測結果中顯示，熒光PCR熔解曲線法與MGIT 960藥敏試驗相比，特異度達到94%以上，敏感度為83.33%，相比特異度略低，可能與試劑盒尚無法覆蓋所有耐藥突變位點以及少量存在的低水平異質性耐藥有關[7，19]。熒光PCR熔解曲線法檢測利福平耐藥突變的敏感度和特異度與MGIT 960藥敏試驗相比具有較高的一致性，均達到95%以上。張國欽等[20]及黃玉平等[21]分別采用線性探針技術對結核分枝桿菌臨床分離株進行耐藥檢測研究，其中對異煙肼耐藥檢測的敏感度分別為68.7%和80.4%，低于本次研究。可能與熒光PCR熔解曲線法多覆蓋的ahpC啟動子區有關。有研究顯示，增加對ahpC啟動子區的檢測，可將異煙肼耐藥的檢測敏感度提高8.5%[7]。馬曉光等[22]應用熒光PCR熔解曲線法對408例結核分枝桿菌臨床分離株進行異煙肼耐藥檢測，與藥敏試驗相比，特異度和敏感度分別為95.32%和87.69%，與本研究相近。而馬艷艷等[23]則應用熒光PCR熔解曲線法對347例結核分枝桿菌臨床分離株進行利福平耐藥檢測，與藥敏試驗相比，特異度和敏感度分別為97.42%和93.42%，也與本研究結果相近。不同之處在于，馬曉光等[22]和馬艷艷等[23]的樣本類型均為結核分枝桿菌臨床分離株，而本研究采用的是痰液樣本。此外，上述兩項研究的對照方法均為比例法固體藥敏試驗，而本研究采用的是MGIT 960液體藥敏試驗。可見，對于不同的樣本類型以及不同的藥敏試驗對照方法，熒光PCR熔解曲線法均可獲得良好的檢測效果。此外，對于熒光PCR熔解曲線法檢測為耐藥，而藥敏試驗結果為敏感的情況，一方面可能由于操作失誤導致錯誤結果；另一方面可能與耐藥突變類型有關，部分突變類型(如rpoB533位點突變)所導致的耐藥水平處于臨界狀態或者僅導致低水平耐藥[24]，可造成檢測結果與藥敏試驗結果出現差異。

目前，已有很多研究表明探針熔解曲線熒光PCR熔解曲線法可用于結核分枝桿菌耐藥突變的快速檢測[10-13]。本次研究也獲得了與傳統方法較為一致的結果，提示熒光PCR熔解曲線法適用于對利福平和異煙肼進行快速耐藥篩查，以輔助臨床診斷。在臨床應用過程中，該方法對加入反應體系的DNA模板質量要求較高，若采用常規水煮法對痰樣本進行DNA提取，可能會因為模板純度低導致熔點偏移或擴增抑制，因此，建議采用磁珠法或其他可獲得高質量模板的提取方法來提取痰樣本。此外，該試劑盒目前僅采用雙色熒光對探針進行標記，對應每個樣本需要2個反應管來實現耐藥檢測，若可以充分利用目前主流實時PCR儀的四個熒光通道，采用四色熒光標記，則能使反應管數減半，進而提高樣本檢測通量。后續可進一步擴大樣本量，確定耐藥突變位點是否有明顯的地域差異以及不同的突變位點的菌株耐藥水平的高低，以期為結核病及耐藥結核病的診治提供參考依據。