冠心病痰瘀互結證小鼠模型的建立與評價研究*

王 朔，梁 如，馮 曼，王鵬偉，高樹明，李 琳，高 杉，殷 佳，于春泉

（天津中醫藥大學，天津 300193）

近年來心血管疾病的發病率逐年上升，已成為全球人口死亡的主要原因[1-3]，其致死率約占所有疾病的30%，其中冠心病隨人群年齡增長而升高，成為世界上發病率、病死率、致殘率和經濟損失較高的主要疾病。冠心病屬于中醫學“胸痛”、“心痛”、“真心痛”等范疇，為本虛標實之證，本虛多為氣虛、血虛、陰虛和陽虛，標實多為氣滯、血瘀、痰濁和寒凝，冠心病中醫證候臨床流行病學調查[4]結果顯示，最常見的證候大多與痰和瘀相關，痰瘀互結證已經成為冠心病現代臨床的基本證候之一。

本研究采用冠狀動脈左前降支結扎聯合高脂飼料喂養載脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）小鼠建立冠心病痰瘀互結證小鼠模型，模型建立后，通過一般狀態、左心室功能、血脂水平、血管內皮因子和病理改變等多方面對冠心病痰瘀互結證發病產生的影響進行探討，為開展方證對應關系研究及中藥作用機制研究提供可參考的動物模型。

1 材料

6周齡SPF級健康雄性純合子ApoE-/-小鼠40只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號為11400700206247，許可證號為 SCXK（京）2016-0011；6周齡SPF級健康的雄性C57BL/6J小鼠30只，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號為11400700206246，許可證號為SCXK（京）2016-0011。高脂飼料由江蘇美迪森醫藥有限公司提供，產品貨號為MD12015。

小動物超聲實時影像系統vevo2100（加拿大）、日本數碼拍攝系統（Olympus DP71）、美國Flex Station 3多功能微孔板分析儀（Molecular Devices公司）、異氟烷（河北九派制藥公司）、膽固醇（TC）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）、甘油三酯（TG）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）、低密度脂蛋白（LDL）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）、高密度脂蛋白（HDL）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）、異丙醇（天津科密歐化學試劑有限公司）、叔戊醇（天津科密歐化學試劑有限公司）、油紅O染液（北京索萊寶科技有限公司）。

2 方法

2.1 實驗分組 實驗動物飼養于天津市南開醫院實驗動物中心SPF級動物房，飼養期間保持環境溫度（22±2）℃，濕度（50±10）%，明暗交替各周期為12 h，分籠飼養，隨機分組，自由進食和飲水。

適應性喂養1周，將40只ApoE-/-小鼠隨機分成血瘀組（15只）、痰濁組（10只）和痰瘀互結組（15只），將30只C57BL/6J小鼠隨機分成空白組（15只）和假手術組（15只）。實驗期間痰濁組和痰瘀互結組喂養高脂飼料12周，其余各組全程給予普通飼料喂養12周。

2.2 模型制備方法 痰濁組：采用高脂飼料喂養12周，期間死亡2只。血瘀組：在8周末行冠狀動脈左前降支結扎術，脫去胸前毛發，使用異氟烷麻醉并進行仰臥位固定，碘伏消毒，沿心臟搏動最明顯處開胸，暴露心臟，在左心耳和肺動脈圓錐之間結扎，術后立即將心臟送回胸腔，迅速擠壓關閉胸腔，縫合創口，使其自行恢復自主呼吸。剔除死亡小鼠5只，繼續飼養至12周。痰瘀互結組：手術方法同血瘀組，同時給予高脂飼料喂養，造模過程中死亡6只，后期飼養過程中死亡2只。假手術組：手術方法同血瘀組，但只進行穿線不結扎。

2.3 指標采集方法

2.3.1 一般狀態觀察 觀察并記錄小鼠體質量變化、活動情況、毛發光澤、厭食情況、二便情況等。

2.3.2 超聲心動檢測小鼠心功能 采用三溴乙醇進行腹腔麻醉，脫去胸前毛發，并固定于操作臺上，調節探頭垂直于小鼠左胸壁，在超聲長軸切面下，可見心臟沿二尖瓣口至心尖方向的左室長軸像。主要檢測指標：左心室射血分數（EF）、左心室短軸收縮率（FS）、左心室質量（LV Mass）、流出道血流速度（LVOT）。分別于第8周末行冠狀動脈左前降支結扎術后和第12周末進行心功能檢測。

2.3.3 血清血脂水平檢測 第12周末進行摘眼球取血，3 500 r/min，10 min 離心，取血清，檢測 TC、TG、LDL-C、HDL-C。

2.3.4 心臟組織蘇木精-伊紅（HE）染色 將心臟組織置于10%中性緩沖福爾馬林固定24 h，經脫水，浸蠟包埋，切片（5μm）烘干后，進行HE染色。在顯微鏡下選取合適視野采集并觀察。

2.3.5 主動脈組織油紅O染色 沿脊柱完整剝離主動脈至雙側髂總動脈，去掉主動脈外壁上脂肪和結締組織，并包于濾紙，放入10%中性福爾馬林固定。將主動脈從10%福爾馬林中取出，用蒸餾水漂洗，經異丙醇浸洗，油紅O染色，異丙醇分化，直至血管壁透明。選取合適角度采集圖像，對主動脈的脂質沉積情況進行描述與分析。

2.4 統計學方法 統計軟件采用SPSS22.0進行統計。實驗各數據以均數±標準差表示。多組間比較采用單因素方差分析法（One-Way ANOVA），組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法。P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般狀態觀察情況 各組小鼠的體質量在第12周均比第0周顯著增加，符合小鼠正常生長規律，有統計學意義（P＜0.01）。空白組、假手術組和血瘀組小鼠的進食量、活動度和二便均正常，未出現下肢水腫。痰濁組和痰瘀互結組由于喂養高脂飼料，從第7周開始進食量有所減少，出現一定的厭食癥狀，活動度有所減少，痰濁組小鼠體質量開始下降，直至第12周明顯降低。痰濁組和痰瘀互結組均未出現下肢水腫，且二便正常，由于喂養高脂飼料，大便呈綠色，相較于空白組、假手術組和血瘀組，毛皮更油膩。見圖1。

圖1 小鼠體質量變化Fig.1 Changes of the weight in mice

3.2 小鼠心臟超聲檢測

3.2.1 造模8周對小鼠心功能的影響 造模8周，行冠狀動脈結扎術后，與空白組或假手術組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結組EF、FS值均顯著降低（P＜0.01），血瘀組和痰瘀互結組左心室質量顯著增大（P＜0.01或P＜0.05），流出道血流速度顯著降低（P＜0.01）；與血瘀組比較，痰瘀互結組的 EF、FS 值顯著降低（P＜0.05）；與血瘀組相比，痰瘀互結組心功能指標明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

表1 造模8周對小鼠心功能的影響Tab.1 Effects of eight weeks of molding on cardiac function in mice

表1 造模8周對小鼠心功能的影響Tab.1 Effects of eight weeks of molding on cardiac function in mice

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與血瘀組比較，△P＜0.05；與痰濁組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

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表2 造模12周對小鼠心功能的影響Tab.2 Effects of twelve weeks of molding on cardiac function in mice（

表2 造模12周對小鼠心功能的影響Tab.2 Effects of twelve weeks of molding on cardiac function in mice（

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

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3.2.2 造模12周對小鼠心功能的影響 造模12周后，與空白組或假手術組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結組 EF、FS值顯著降低（P＜0.01或 P＜0.05），左心室質量顯著增加（P＜0.01或 P＜0.05），痰瘀互結組流出道血流速度顯著降低（P＜0.01）。見表2。

3.3 小鼠血脂水平的變化 與空白組或假手術組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結組TG、LDL顯著升高（P＜0.01或 P＜0.05），痰瘀互結組 TC、HDL 顯著升高（P＜0.01）；與血瘀組比較，痰濁組 TG、LDL 顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01），痰瘀互結組 TC、HDL 顯著升高（P＜0.01）；與痰濁組比較，痰瘀互結組TC、HDL-C 顯著升高（P＜0.01）。見表 3。

3.4 心臟組織和主動脈組織病理變化

3.4.1 主動脈竇HE染色 空白組及假手術組主動脈竇內膜完整光滑，主動脈厚薄均勻，未見脂質條紋或纖維斑塊，主動脈瓣形態正常，細胞排列整齊，瓣膜附著處見正常心肌細胞。血瘀組主動脈內膜明顯增厚，管壁厚度不均，部分管壁向管腔內突出，外膜可見炎癥細胞浸潤和水腫，部分瓣膜上有纖維斑塊形成。痰濁組主動脈內膜顯著增厚、廣泛纖維化，內膜下有大量脂質沉淀，可見大面積的粥樣斑塊，斑塊中有大量泡沫細胞和粥樣斑塊病灶，外膜出現明顯的炎細胞、漿細胞浸潤。痰瘀互結組主動脈內膜顯著增厚，主動脈壁厚薄程度不均勻，主動脈瓣變形、增厚，可見成熟的粥樣斑塊，管腔顯著狹窄，瓣膜附著處出現大面積的粥樣斑塊，有大量泡沫細胞，斑塊中大量脂質融合成片，可見大片粥樣壞死核和大量梭狀膽固醇結晶，外膜出現明顯的炎細胞、漿細胞浸潤。見圖2。

與空白組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結組斑塊面積和斑塊占管腔面積的百分比均明顯升高（P＜0.01），與假手術組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結組的斑塊面積顯著增大，斑塊占管腔面積百分比均顯著升高（P＜0.01），與血瘀組相比，痰濁組斑塊面積增大（P＜0.01），痰瘀互結組的斑塊面積和斑塊占管腔面積比值明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表4。

3.4.2 主動脈組織病理變化 經油紅O染色后，空白組和假手術組主動脈內膜光滑平整，可見少量紅色點狀脂斑散在分布。血瘀組紅色塊狀脂斑分布于整個主動脈，且斑塊主要集中在主動脈弓分叉處及主動脈中部，主動脈弓部斑塊最集中，呈塊狀分布，病變處的動脈壁增厚。痰濁組主動脈內膜上有較多斑塊，較集中于主動脈弓部及腹主動脈以下的部位，腹主動脈部位可見大片紅色塊狀脂斑，面積較大，斑塊沉積部位管壁明顯增厚。痰瘀互結組主動脈紅色斑塊主要集中分布在主動脈弓部及腹主動脈以下的部位，病變部位管壁顯著增厚，主動脈弓部可見大量斑塊集中分布，面積較大，腹主動脈區域也可見較多塊狀斑塊。見圖3。

與空白組比較，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結組主動脈內膜的斑塊面積顯著增大（P＜0.01），與假手術組相比，血瘀組、痰濁組和痰瘀互結組主動脈內壁上斑塊的面積顯著增大（P＜0.01），與血瘀組比較，痰瘀互結組主動脈所沉積的斑塊面積顯著增大（P＜0.05）。見表 5。

表3 小鼠血脂水平的變化（Tab.3 The change of lipid levels in mice（mmol/L

表3 小鼠血脂水平的變化（Tab.3 The change of lipid levels in mice（mmol/L

注：與空白組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與假手術組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，與血瘀組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與痰濁組比較，▲▲P＜0.01。

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圖2 主動脈竇病理變化結果（×100）Fig.2 Results of pathological changes of aortic sinus（×100）

4 討論

冠心病有動脈粥樣硬化與心肌缺血的雙重病理特征，中醫將動脈粥樣硬化與血脂的升高作為“痰”的表現，將心肌缺血和血液流變學的變化作為“瘀”的表現，故冠心病易表現出痰瘀等病理癥狀[5]。冠心病是由于冠狀動脈粥樣硬化引發的，而脂質代謝異常則是導致動脈粥樣硬化的主要原因，研究結果顯示，因脂質代謝異常引起的高脂血癥是導致動脈粥樣硬化的主要因素，為冠心病的啟動因子和促進因子[6]，同時，動脈粥樣硬化的形成、發展和斑塊的破裂是冠心病發展的病理基礎，因此，血脂代謝紊亂，痰阻血脈可看作冠心病的誘因，為血液流變方面的異常變化，瘀血阻礙氣機，可看作冠心病的促進因素，痰瘀兩者相互搏結、互為因果，影響津液的運化，形成痰瘀相隨、痰瘀病損的發展過程，最終引發冠心病。這也從脂質代謝的角度對中醫理論中“痰”和“瘀”的產生和轉歸進行了解釋[7-8]。

ApoE是血漿中一種重要的載脂蛋白[9]，主要通過調節CM殘粒受體及LDL受體的配體功能發揮作用，影響機體脂代謝功能及膽固醇平衡，因此與動脈粥樣硬化的發生、發展密切相關。ApoE-/-小鼠是公認的研究AS發病機制較理想的動物模型[10]，由于缺乏ApoE基因，殘粒代謝速度加快，導致LDL合成增加，LDL受體下降，分解降低，使LDL代謝障礙，表現為血脂水平明顯異常，脂質沉積于血管壁，容易形成AS病灶，因此更容易形成是冠心病、動脈粥樣硬化，故本研究采用ApoE-/-小鼠作為冠心病痰瘀互結證的研究對象[11]。

本實驗采用冠狀動脈左前降支結扎聯合喂養高脂飼料ApoE-/-小鼠建立冠心病痰瘀互結證小鼠模型，通過結扎冠狀動脈左前降支，造成冠心病中心肌缺血的病理特征，以模擬冠心病痰瘀互結證中“瘀”[12]的癥狀，通過喂養高脂飼料，使ApoE-/-小鼠脂質代謝紊亂，形成冠心病中動脈粥樣硬化的病理特點，以模擬冠心病痰瘀互結證中“痰”[13]的特征。研究結果表明，相較于假手術組，痰瘀互結組的心功能明顯損傷，符合冠心病痰瘀互結證“瘀”的病理癥狀；相較與假手術組，痰瘀互結組血清中血脂水平異常，主動脈竇處有明顯的粥樣斑塊，主動脈管腔顯著狹窄，主動脈大體油紅O染色斑塊面積顯著，具有明顯的動脈粥樣硬化的特點，符合冠心病痰瘀互結證“痰”的病理特征。綜上所述，本次實驗通過冠狀動脈左前降支結扎聯合高脂飼料喂養ApoE-/-小鼠成功建立冠心病痰瘀互結證小鼠模型。

表4 主動脈竇斑塊面積以及管腔狹窄程度結果（Tab.4 Results of aortic sinusplaque area and degree of stenosis

表4 主動脈竇斑塊面積以及管腔狹窄程度結果（Tab.4 Results of aortic sinusplaque area and degree of stenosis

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術組比較，**P＜0.01，與血瘀組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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圖3 主動脈油紅O染色結果Fig.3 Aortic oil red O staining results

表5 主動脈內膜斑塊面積結果Tab.5 Results of aortic intimal plaqueareaμm2

表5 主動脈內膜斑塊面積結果Tab.5 Results of aortic intimal plaqueareaμm2

注：與空白組比較，##P＜0.01；與假手術組比較，**P＜0.01；與血瘀組比較，△P＜0.05。

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