不同培養條件對翠云草顏色的影響

金卓　丁濱　王照磊　倪鑫濤　王超

摘 要：本研究通過拍照、利用CAD軟件計算對比明確了0.2mg/L 2，4-D（2，4- 二氯苯酚代乙酚）能顯著促進翠云草生長；激素和土壤對翠云草葉色變化影響不明顯；翠云草葉片中葉綠素a/b比值為2.26±0.04；在藍色光照射下葉片中兩種葉綠素含量顯著增加，單克葉片中PAL的活性和翠雀素-3-O-葡萄糖的濃度顯著增加，肉眼觀察翠云草葉片呈藍色。

關鍵詞：翠云草；培養條件；葉綠素；翠雀素；苯丙氨酸解氨酶（PAL）

中圖分類號：S682.35 文獻標志碼：A 文章編號：2095-2945（2018）21-0046-03

Abstract： In this study， it was found that 0.2 mg/L 2o-D（2， 4-dichlorophenol） could significantly promote the growth of Turquoise grass by taking photos and calculating and contrasting with CAD software， but the effects of hormones and soil on the leaf color of Turquoise grass were not obvious. The ratio of chlorophyll a/b was 2.26±0.04. Under blue light irradiation， the contents of chlorophyll in leaves increased significantly， the activity of PAL and the concentration of aliphin-3-O-glucose in single gram leaves increased significantly. The leaves of Turquoise grass showed blue color by naked eye observation.

Keywords： Turquoise grass； culture condition； chlorophyll； lark； phenylalanine ammonia-lyase （PAL）

翠云草（Selaginella uncinnata）屬蕨類石松亞門卷柏屬多年生草本植物，別稱藍地柏、綠絨草、藍草等，是一種在我國南部山區較為常見的蕨類。翠云草，因其特有性質和嬌俏外形而具有“動靜”兩方面的應用價值：“動”可藥用[1]，已有研究發現翠云草中富含黃酮、酚類、甾體皂苷類等化學成分[2-3]，具有一定的抗病毒、抗衰老、抗腫瘤、平喘、祛痰止咳、抗菌等活性[4-5]，現己建立起合理可行的質量控制方法，具有較好的開發前景；“靜”可觀賞，翠云草布葉勻稱，蔓生抬頭， 為小型觀葉植物。翠云草株態靈奇，全年翠綠光潤偶帶藍色熒光，在花卉市場上是十分暢銷的觀葉盆栽[6]。室內做盆栽裝點，室外還可做植被點綴，且水培、土培和沙培皆宜，效果別具一格。

在實際培育翠云草的過程中，由于其有生長速度慢，受環境影響大，藍葉色不易顯現等現象，很難以觀賞植物的角色在我國商業化。本實驗著眼于影響翠云草生長和葉色變化的各種因素的優化，得到了一組易于翠云草生長和其葉色顯藍的環境參數。

1 材料與試劑

實驗所用翠云草于浙江省溫州市雁蕩山采集（北緯28°21′52″東經121°5′0″海拔200米左右），經由浙江中醫藥大學丁志山教授鑒定確為翠云草（Selaginella uncinnata）。本研究所用試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。實驗器材包括立式壓力蒸汽滅菌鍋，型號YXQ-LS-100SII，購于上海博訊實業有限公司；pH計，實驗室pH計 FiveEasy，購于Mettler Toledo；電熱恒溫水槽，型號DK-450B，購于上海森信實驗儀器有限公司；分光光度計，型號Ultrospec 3300pro UV/Visible Spectrophotometer，購于Amersham Biosciences；冷凍離心機，購于Thermos Scientific；高效液相色譜，Ultimate3000；色譜柱，Acclaim 120 C18 5um 120A 4.6X250m

m，購于Dionex。

2 方法

2.1 培養條件對翠云草葉色的影響

采用恒溫溫室培養，溫度控制為25±2℃；在翠云草生長期間保持培養基不干燥，保持葉片的濕潤。在篩選最適激素實驗中，選取長勢良好、生長茂盛、有藍綠色光澤且含一個不定根的翠云草莖分別培養在含不同激素的1/2 MS（pH 6.0）無糖培養基中（詳見表1）。在5個實驗周期間，每周觀察兩次其生長及葉色的變化，利用平行拍攝和Auto CAD軟件對比分析其根長、株長的變化。

土壤實驗中選擇紅土、黃土和泥炭土三種常見的觀賞植物用土作為變量，在其它條件相同情況下培養，觀察翠云草葉色的變化。

光質影響實驗中采用不同波長的LED燈為光源，分別為紅光（620-625nm）、橙光（585-590nm）、綠光（520-525nm）、藍光（465-470nm）、白光（390-780nm）、無光源照射六個實驗組，在其它條件相同情況下，培養觀察葉色的變化。

2.2 葉綠素和翠雀素含量的測定

參考王二雷[7]測定藍莓中翠雀素含量的方法，用高效液相色譜比積法測定翠雀素含量。采用80%丙酮提取翠云草中的葉綠素，含量測定方法參考2008年崔曉靜的研究[8]。

2.3 PAL活性的測定

根據崔曉靜研究中的方法測定PAL活性[8]，以L-苯丙氨酸（L-phe）為底物，翠云草葉片組織作為酶源，酶促生成產物反式-肉桂酸（t-Ca）測定苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的紫外分光光度法。

3 結果

3.1 激素對翠云草生長和葉色的影響

通過拍照和Auto CAD軟件分析發現，0.2mg/L NAA、0.5mg/L KT及0.5mg/L 6-BA對翠云草根和植株均沒有明顯的促生作用，累計增長率未超過10%。并且在0.5mg/L 6-BA的影響下翠云草根部甚至出現負增長的現象。0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4能夠顯著促進翠云草根生長，累計增長26.33%（P<0.05），但對翠云草株長影響不大。0.2mg/L 2，4-D則對根和地上部分都有明顯促增長作用，分別為13.48%和25.56%（P<0.05詳見圖1，2）。

六周后對翠云草的葉色進行對比觀察，發現總體各組別葉色均沒有顯著變化。0.5mg/L KT和0.5mg/L 6-BA組葉片略顯黃色，0.2mg/L NAA和0.2mg/L 2，4-D組較未處理組更綠，而0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4組未見變化。

3.2 土壤對翠云草的影響

在接下來的實驗中我們以0.2mg/L 2，4-D 1/2MS培養液澆灌，分別以黑土、紅土、泥炭土以及雁蕩山當地土壤為基質進行對比實驗。發現在不同的土質比較實驗中，翠云草在黑土、紅土和泥炭土條件下的生長情況無明顯差異，因而仍采用雁蕩山土質進行后續實驗。（詳見圖3）

3.3 光質對翠云草生長和葉色變化的影響

在光質實驗中，目測藍光（465-470nm）和白光（390-780nm）照射下翠云草生長較迅速，在藍光葉片變藍。

3.3.1 葉綠素含量的定量分析

在實驗前、后取不同組翠云草葉片，分別定量分析其中葉綠素a、b的含量，計算葉綠素a與b值（表3）。對比發現翠云草葉綠素a/b值為2.26±0.04，不同波長照射對葉綠素a、b含量影響不同。紅光照射后葉綠素a含量降低而葉綠素b含量增加，葉綠素a/b值降到0.61。而藍色光照射后兩種葉綠素含量增加明顯，葉綠素a/b值為1.05。作為對照，白光和無光照培養條件下葉綠素a/b值幾乎不變。

3.3.2 翠雀素含量

在本實驗以藍莓中的矢車菊素-3-O-葡萄糖苷、矢車菊素-3-O-半乳糖苷、翠雀素-3-O-葡萄糖苷以及翠雀素-3-O-半乳糖苷為相對標準品。通過HPLC法對翠云草中翠雀素進行半定量分析，其中翠雀素-3-O-葡萄糖苷在不同光質照射下含量有所變化，如圖4所示。

3.3.3 PAL活性

PAL是植物中催化酚類次生代謝產物合成的重要蛋白質，與翠雀素合成有關。在對該酶酶活性連續6周的跟蹤測定中發現，紅、藍光對PAL活性有顯著影響，PAL活性增長率超過300%，達到350U/g；而橙、白光對PAL活性影響不大，始終維持在100-200U/g；PAL活性在綠光和無光條件下明顯降低（見圖5）。

4 結束語

為保證有足夠的實驗材料，我們首先通過實驗篩選出最適合翠云草生長的培養基配方和土壤基質，發現含0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4（pH6.0）的1/2 MS不含糖培養基對翠云草生根最為有利，而0.2mg/L 2，4-D能夠同時促進翠云草根和地上部分生長。有實驗證明0.2mg/L NAA+200mg/L NaH2PO4促翠云草生根的作用與其它蕨類植物作用相似[9-10]，2，4-D還能夠誘導烏毛蕨[11]等蕨類植物形成愈傷組織，而激素、土質對翠云草葉色影響不大。

翠云草是一種陰生植物，葉片中葉綠素a/b的比值在2左右，能夠更充分利用短波長的光，即藍紫光。在光質實驗中，對比分析葉綠素a、葉綠素b和花青素中的一種翠雀素的含量，發現經過藍光照射三種葉綠素的含量均有增加，葉綠素b和翠雀素-3-O-半乳糖苷含量明顯增加。張水木等[12]用不同顏色彩色膜和遮蔭處理的室外光照條件下培養翠云草，發現翠云草在不同光質條件下色素苷的含量變化極明顯，這與本實驗結論一致，而葉綠素含量變化不明顯，推測是由于培養條件不同導致。翠雀素是植物花色和葉色呈現藍色的主要成分原因，PAL則是翠云草色素苷合成反應的首個關鍵酶，其活性的變化直接能改變翠云草葉色的變化。在藍光照射下翠云草葉片中PAL活性也顯著上升，增加3.5倍，而翠雀素-3-O-半乳糖苷含量變化不大（陰性結果未展示），推測可能是因為缺少翠雀素-3-O-半乳糖苷合成有關的底物或蛋白。

本研究對藍色翠云草的室內培養條件進行了初步探索，為種植和推廣該變色的觀賞植物提供了實驗依據。

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