布洛芬對活性污泥中功能酶活性的影響

趙晶晶，董玉瑛，方政，鄒學軍

大連民族大學 環境與資源學院，大連116605

醫藥品、個人護理品以及內分泌干擾物等新型有機污染物(emerging organic contaminants，EOCs)多為具有生物活性物質，其進入水體環境，可誘發水生生物發生不同應激變化，對生態環境和生物健康的危害風險較大[1]。其中布洛芬(IBP，C13H18O2)是具有抗炎、鎮痛、解熱作用的常用非甾體抗炎藥，使用劑量較大，達1 200 mg·d-1[2]，同時已有研究在不同來源水體中檢測到其存在[3-5]。各類有機物需進入城市污水廠經生化處理達標后排放，其過程中穩定的污泥處理效果是保障出水水質達標的重要基礎，而污水處理廠污泥中存在著數量眾多、遺傳與代謝方式多樣的微生物，它們在污染物的去除中發揮著關鍵驅動作用。但微生物無法完全去除大部分新型有機污染物，如國內污水處理廠布洛芬的去除率約為41.6%[6-7]，去除率低。并且新型有機污染物多具有生物毒性[8-9]，會影響水處理效果。已有研究發現，污水中的有毒物質超過一定濃度時，會影響和干擾微生物的正常代謝，進一步影響污水生物處理效果[10]。

不同酶的功能有特異性，是污泥活性的直接反應。活性污泥生物代謝功能與一系列酶活性密切相關[11]。這些酶擔負著凈化污水的使命，同時其功能也會受到污水中具有生物活性EOCs存在的影響[12]。因此，測定EOCs對污泥微生物群落的影響、篩選影響污泥生態功能的敏感指標，可及時預警污水處理系統污泥活性出現異動的情況。

因為如布洛芬的新型有機污染物使用量大、去除率低，且藥品的存在會影響活性污泥微生物的活性，而傳統的監測指標存在不足。所以需要篩選敏感污泥活性指標，以有效預測風險。研究通過將活性污泥暴露于布洛芬存在的條件下進行相關指標分析，主要選擇活性污泥中脲酶活性、轉化酶活性為主要分析指標。對各指標進行對比分析，為篩選敏感污泥活性指標、有效預測可能出現的環境風險提供基礎數據。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 儀器與材料

UV-1000分光光度計(上海，美普達儀器有限公司)；THZ-B臺式恒溫振蕩器(常州，諾基儀器有限公司)；PHP-9082型電熱恒溫培養箱(上海，一恒科技有限公司)；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海，精宏實驗設備有限公司)。

實驗用布洛芬購自海外制藥有限公司。其他試劑均為分析純。實驗中所用活性污泥均取自大連某污水處理廠的曝氣池，其基本理化指標：混合液懸浮固體(MLSS)1 609 mg·L-1；揮發性懸浮物(VSS)0.7 mg·L-1；污泥容積指數(SVI)80～120 mL·g-1；濁度3 500～3 700 mg·L-1，耗氧速率(OUR)3 mg·g-1·h-1。污泥在進行后續實驗前進行充分的曝氣培養。

1.2 生化指標分析方法

1.2.1 脲酶活性分析方法

脲酶的活性測定應用苯酚鈉比色法[13]。通過多組空白試驗，確定活性污泥脲酶活性的穩定時間段，根據實驗時間要求控制污泥與藥品的暴露時間。將污泥與0～40 μg·L-1的布洛芬等體積混合暴露。隨后將污泥懸濁液與甲苯充分混合，加入10%的尿素溶液和檸檬酸緩沖溶液，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。取濾液加入苯酚鈉和次氯酸鈉，混勻后靜置。溶液在稀釋后于578 nm測吸光度。每組設置2個平行樣。同時設置無土對照與無基質對照，用以檢驗試劑純度和基質自身分解。無土對照即不加土樣，其他操作與樣品實驗相同。無基質對照即以等體積的水代替基質，其他操作與樣品實驗相同。

1.2.2 轉化酶活性分析方法

轉化酶的活性測定應用3,5-二硝基水楊酸法[13]。通過多組空白試驗，確定活性污泥轉化酶活性的穩定時間段，根據實驗時間要求控制污泥與藥品的暴露時間。將污泥與0～40 μg·L-1的布洛芬等體積混合，暴露15 h。隨后將污泥懸濁液中加入磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液、10%的蔗糖溶液和甲苯溶液，置于37 ℃恒溫培養箱中培養24 h。取濾液加入3,5-二硝基水楊酸溶液，沸水浴加熱，然后冷卻，稀釋后于578 nm測吸光度。每組設置2個平行樣。同時設置無土對照與無基質對照，用以檢驗試劑純度和基質自身分解。無土對照即不加土樣，其他操作與樣品實驗相同。無基質對照即以等體積的水代替基質，其他操作與樣品實驗相同。

1.3 數據統計與分析

1.3.1 酶活性表征

活性污泥中酶活性的計算方法參關松萌[13]的酶活性計算方法。酶活性以24 h后1 g烘干污泥對應生成產物的質量表示。

脲酶活性以24 h后1 g烘干污泥對應NH3-N生成量的毫克數表示：

(1)

式中：a樣品為樣品吸光度值對應標準曲線求得的NH3-N毫克數；a無污泥為無污泥對照吸光度值對應標準曲線求得的NH3-N毫克數；a無基質為無基質對照吸光度值對應標準曲線求得的NH3-N毫克數；V為顯色液體積(mL)；n為分取倍數，即浸出液體積/吸取濾液體積；m為烘干污泥的質量(g)。

轉化酶活性以24 h后1 g烘干污泥對應葡萄糖生成量的毫克數表示：

(2)

a樣品為樣品吸光度值對應標準曲線求得的葡萄糖毫克數；a無污泥為無污泥對照吸光度值對應標準曲線求得的葡萄糖毫克數；a無基質為無基質對照吸光度值對應標準曲線求得的葡萄糖毫克數；V為顯色液體積(mL)；n為分取倍數，即浸出液體積/吸取濾液體積；m為烘干污泥的質量(g)。

圖1 酶活性與暴露時間關系Fig. 1 Relationship between enzyme activity and exposure time

圖2 不同濃度布洛芬對污泥脲酶活性的影響Fig. 2 Effect of different concentrations of ibuprofen on urease activity

1.3.2 酶活性變化率分析

以布洛芬暴露濃度與酶活性的動態變化率、總變化率的劑量-效應關系表示酶活性在布洛芬暴露下的變化情況。

(3)

式中：R為酶活性變化率，Rn為本測定點酶活性值，Rn-1為上一測定點酶活性值，R0為布洛芬暴露濃度為零時的酶活性值。

酶活性動態變化率表達的是酶活性在本測定點與上一測定點區間內的變化情況，是對酶活性變化的動態分析，強調相鄰測定點區間內的變化情況。

(4)

式中：I為酶活性抑制率，I0為布洛芬暴露濃度為零時的酶活性值，In為本測定點酶活性值。

酶活性總變化率表達的是酶活性在某一濃度點與零濃度點相比的變化程度，是對酶活性總體變化情況的分析，強調總體趨勢。

2 結果與討論(Results and discussion)

2.1 污泥酶活性穩定時間

通過多組空白試驗數據，確定活性污泥酶活性的穩定暴露時間，發現對于脲酶活性，暴露時間為5 h時，脲酶活性總變化率為15.2%；暴露時間為30 h時，脲酶活性總變化率為22.4%；其余暴露時間下，脲酶活性較為穩定，總變化率不超過±3%。對于轉化酶活性，暴露時間為30 h時，轉化酶活性總變化率為16.7%；其余暴露時間下，轉化酶活性較為穩定，總變化率不超過±6%。

因此我們選擇暴露時間在脲酶和轉化酶活性同時穩定的時間，并根據實驗時間要求控制污泥與藥品的暴露時間為15 h。

2.2 脲酶活性響應

脲酶(urease)是一種能促進含氮有機物水解的水解酶，對污水中含氮有機物的分解具有重要意義[14]。脲酶活性值與布洛芬濃度有顯著的相關關系。脲酶活性動態變化率隨布洛芬濃度升高先小幅度提升，在布洛芬濃度達到28 μg·L-1后呈現出了單調遞減趨勢。在布洛芬濃度達到35～40 μg·L-1時，對脲酶活性的抑制程度超過了40%。試驗結果表明，28～40 μg·L-1的布洛芬對活性污泥微生物的脲酶活性有顯著的抑制作用，隨著暴露濃度的增加，持續表現出抑制。而布洛芬與脲酶活性總變化率的劑量-效應圖表明，脲酶活性在0～40 μg·L-1的布洛芬暴露下總體為抑制作用，布洛芬濃度達28 μg·L-1后，

圖3 不同濃度布洛芬對污泥轉化酶活性的影響Fig. 3 Effect of different concentrations of ibuprofen on invertase activity

脲酶活性總變化率單調增加，存在顯著的劑量-效應相關性。在布洛芬濃度達到40 μg·L-1時，脲酶活性總變化率超過了70%。實驗結果表明，布洛芬脅迫濃度較低時，受外界條件刺激微生物代謝活性增強，微生物受到外界污染物影響時，為減少對自身的毒害，需要通過代謝作用將其分解，脲酶能促進含氮有機物的水解，當活性污泥中布洛芬脅迫濃度較低時，受外界條件刺激下，微生物代謝活性增強[15]，加速了布洛芬的降解和轉化；而隨著暴露濃度的繼續增加，有毒物質導致了脲酶等水解酶的活性下降，脲酶的活性呈現單調遞減趨勢，這是因為當活性污泥中毒物質量過高時，會破壞微生物細胞結構，降低其氧化代謝能力。此在實驗濃度范圍內布洛芬的存在會影響脲酶分解含氮有機物的活性，誘導了不利應激變化。閆穎等[16]的研究也發現低濃度除草劑阿特拉津對土壤脲酶的活性有促進作用，而高濃度阿特拉津降低了脲酶的活性。

實驗結果也解釋了出水氨氮發生異常時，數據往往上升迅速的現象。通過對污染物對脲酶活性影響的分析，可較為準確和迅速地判斷污水處理的異動情況。同時可以采取及時的控制措施，縮短系統的恢復時間。

2.3 轉化酶活性響應

轉化酶(invertase)可增加污泥中易溶性營養物質，對污泥中的碳循環有重要作用[17]。而轉化酶活性值隨暴露濃度增加活性總體趨于穩定，表現出良好的耐受性。轉化酶活性動態變化率范圍不超過±20%，轉化酶活性總變化率的變化表明，與空白相比轉化酶活性呈現出了一定的抑制現象，但總變化率變化趨勢不明顯。實驗濃度范圍內在布洛芬濃度為35 μg·L-1時轉化酶活性總變化率達到峰值，但最大總變化率未超過30%。因此，轉化酶活性對布洛芬實驗范圍內濃度變化不敏感。陳青林[18]的阿特拉津對土壤酶活性影響的研究也表明，土壤脲酶對阿特拉津的敏感程度大于轉化酶對阿特拉津的敏感程度。

通過對比活性污泥中脲酶、轉化酶的活性變化率在布洛芬0～40 μg·L-1暴露下的變化，我們發現：不同種類酶活性對布洛芬暴露的響應不同，隨毒性作用的不斷增強，脲酶活性先被激活，后被抑制；轉化酶活性變化不明顯。轉化酶活性動態和總變化率波動幅度均低于脲酶活性動態和總變化率，因此轉化酶活性指標在實驗濃度范圍內對布洛芬的敏感程度低于脲酶活性指標。脲酶活性在布洛芬較低暴露濃度下明顯顯示出抑制作用，且變化幅度大、響應快，因此推薦使用脲酶活性指標作為評價布洛芬等新型有機污染物對復雜污泥機制中活性污泥微生物活性影響的重要敏感酶指標。