HPLC同時測定黑老虎藥材中2種三萜酸的含量

彭富全 陳明權 何風雷 楊能英 蔣向軍 農根林

[摘要] 目的 建立黑老虎中12-乙酰氧基黑老虎酸和開環新五味子酸A的含量測定方法。 方法 采用超聲法提取藥材，色譜柱為Atlantis T3-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（80∶20），檢測波長：210 nm，流速1.0 mL/min，柱溫為30℃。 結果 12-乙酰氧基黑老虎酸進樣量在0.0157～0.3140 μg與峰面積值呈現良好的線性關系（r = 0.9998），平均回收率為100.4%，相對標準差（RSD）為2.58%（n = 6）；開環新五味子酸A進樣量在0.0848～1.6960 μg與峰面積值呈現良好的線性關系（r = 0.9999），平均回收率為101.1%，RSD為1.21%（n = 6）。 結論 該方法準確、簡便、重復性好，可用于黑老虎藥材中12-乙酰氧基黑老虎酸和開環新五味子酸A的含量測定。

[關鍵詞] 黑老虎；12-乙酰氧基黑老虎酸；開環新南五味子酸A；高效液相色譜

[中圖分類號] R284.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）08（a）-0031-04

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of 12-acetoxycoccinic acid and seco-neokadsuranic acid A in root of Kadsura coccinea. Methods Ultrasonic method was used to extract the herbs. HPLC chromatographic conditions included the Atlantis T3-C18 （4.6 mm×250 mm， 5 μm） column， using acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （80∶20） as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 310 nm and the column temperature was maintained at 30℃. Results The calibration curve of 12-acetoxycoccinic acid was in good linearity over the range of 0.0157-0.3140 μg （r = 0.9998）. The average recovery was 100.4% with RSD of 2.58% （n = 6）. And the calibration curve of seco-neokadsuranic acid A was in good linearity over the range of 0.0848-1.6960 μg （r = 0.9999）. The average recovery was 101.1% with RSD of 1.21% （n = 6）. Conclusion The method is accurate， simple， reproducible， and can be used to determine the content of 12-acetoxycoccinic acid and seco-neokadsuranic acid A in the root of Kadsura coccinea.

[Key words] Kadsura coccinea； 12-acetoxycoccinic acid； Seco-neokadsuranic acid A； High performance liquid chromatography

黑老虎為五味子科南五味子屬植物厚葉五味子Kadsura coccinea（Lem.）A.C. Smith的干燥根，別名冷飯團、布福娜、緋紅南五味子、過山龍藤、鉆地風等，主要分布于我國廣東、廣西、福建等嶺南地區，以及越南、緬甸等東南亞國家[1]。味辛、性溫，具有行氣活血、祛風止痛的功效，主要用于治療風濕痹痛、痛經、脘腹疼痛、跌打損傷等；常用于胃、十二指腸潰瘍、慢性胃炎、急性胃腸炎、風濕性關節炎等病[2]，為名優中成藥“舒筋健腰丸”“壯腰健腎丸”等產品的主要原料藥之一。現代研究表明，黑老虎主要含有木脂素和三萜類化合物，它們具有抗肝炎、抗HIV病毒、抗腫瘤、抗氧化、血小板活化因子拮抗作用及對血管平滑肌的舒張作用等藥理活性[3-5]。

目前，《廣東省中藥材標準》等地方標準對黑老虎的質量控制項中，僅有性狀鑒別、顯微鑒別及薄層鑒別，無“含量測定”項[2]。近年來，國內外許多學者對黑老虎的研究主要集中于繁殖、栽培、化學成分及藥理作用等方面，其中，有效活性成分一直都是研究的重點[6-18]。文獻調研可知，木脂素類和三萜類是黑老虎的主要生物活性成分，其中三萜酸類成分“12-乙酰氧基黑老虎酸”具有顯著的抗HCV活性，可用于制備抗丙肝病毒的藥物[19]；“開環新五味子酸A”也具有一定的抗癌活性[20]，而關于黑老虎中三萜酸類成分定量分析的文獻尚未見報道。本研究首次建立了高效液相色譜法（HPLC）同時測定不同產地黑老虎中兩種三萜酸（12-乙酰氧基黑老虎酸、開環新五味子酸A）的含量，以期為黑老虎藥材的資源合理開發及品質評價提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜議（美國安捷倫公司）；Atlantis T3-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國安捷倫公司）；Agilent DAD檢測器（美國安捷倫公司）；Millpore simplicity-67120型超純水器（美國密理博公司）；BS110S型萬分之一電子分析天平（德國賽多利斯公司）；WXJ型粉碎機（上海凱旋中藥機械制造有限公司）；KQ-100DV超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品12-乙酰氧基黑老虎酸（上海一林生物科技有限公司，批號：20171011，純度98%）；對照品開環新南五味子酸A（上海一林生物科技有限公司，批號：20171011，純度98%），由該公司從黑老虎藥材中分離得到晶體化合物，通過對其進行結構解析、鑒定，發現該化合物的光譜數據、理化常數與文獻[20]報道的seco-neokadsuranic acid A完全一致，因此，可以確定黑老虎中也具有開環新南五味子酸A成分。乙腈（Fisher，色譜純）；冰醋酸（天津市科密歐化學試劑有限公司，色譜純）；液相用水超純水，其他試劑均為分析純。

8個黑老虎藥材樣品，分別采自廣東（S1～S4號）、廣西（S5～S6號）、福建（S7～S8號），以上樣品均經廣州中醫藥大學中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為五味子科南五味子屬植物冷飯團Kadsura coccinea（Lem.）A.C. Smith的根。樣品具體信息見表1。

2 方法與結果

2.1 HPLC色譜條件

色譜柱為Atlantis T3-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液（80∶20）。檢測波長：210 nm；流速1.0 mL/min；柱溫為30℃；進樣量：10 μL。在該條件下，混合對照品及黑老虎樣品的色譜圖見圖1。

2.2 供試品溶液的制備

取黑老虎樣品粉末0.50 g（過60目篩），精密稱定，置100 mL錐形瓶中，精密加入95%乙醇50 mL，稱定重量，超聲提取45 min，放冷至室溫，補重，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取12-乙酰氧基黑老虎酸1.57 mg，開環新五味子酸A 8.48 mg對照品，置100 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為15.7、84.8 μg/mL的混合對照品溶液。4℃保存備用。

2.4 線性關系考察

分別精密吸取上述混合對照品溶液1、2、5、10、15、20 μL，按“2.1”項色譜條件下進樣分析，以各成分峰面積 Y為縱坐標，以進樣量X（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，并求出12-乙酰氧基黑老虎酸和開環新五味子酸A的回歸方程分別為Y = 0.2321X + 0.101（r = 0.9998）和Y = 0.4719X + 0.1502（r = 0.9999）。結果顯示，12-乙酰氧基黑老虎酸和開環新五味子酸A的進樣量分別在0.0157～0.3140 μg和0.0848～1.6960 μg之間與峰面積值呈現良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取混合對照品混合溶液10 μL，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，測得峰面積積分值，計算相對標準偏差（RSD），結果12-乙酰氧基黑老虎酸的RSD為1.35%，開環新五味子酸A的RSD為0.96%，提示儀器的精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取供試品溶液，分別在0、3、6、12、24、48 h按“2.1”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，計算得12-乙酰氧基黑老虎酸峰面積的RSD為1.62%，開環新五味子酸A的RSD為1.07%，提示供試品溶液在48 h內穩定。

2.7 重復性試驗

精密稱取同一供試樣品6份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行HPLC分析。測得峰面積積分值，計算相對標準偏差，結果12-乙酰氧基黑老虎酸峰面積的RSD為1.97%，開環新五味子酸A的RSD為1.21%，提示方法重復性良好。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已測定的黑老虎藥材（編號：S5）粉末0.50 g，共6份，分別精密加入12-乙酰氧基黑老虎酸對照品溶液（濃度為0.038 mg/mL）和開環新五味子酸A對照品溶液（濃度為0.482 mg/mL）各1 mL，按供試品溶液制備方法制備，進樣10 μL，注入HPLC色譜儀，測其峰面積，計算回收率。12-乙酰氧基黑老虎酸平均回收率為100.4%，RSD為2.58%（n = 6），開環新五味子酸A平均回收率為101.1%，RSD為1.21%（n = 6）。見表2。

2.9 樣品的測定

取不同產地黑老虎樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件測定含量，結果見表3。從表3可以得知，8個產地黑老虎中2種三萜酸的含量存在明顯差異，不同產地藥材中12-乙酰氧基黑老虎酸的含量大小依次為福建永定>廣西防城港>廣西恭城>廣東懷集>廣東始興>福建武平>廣東蕉嶺、廣東佛岡，而開環新南五味子酸A的含量大小依次為廣西防城港>廣東蕉嶺>廣西恭城>福建武平>福建永定>廣東始興>廣東懷集>廣東佛岡，其中12-乙酰氧基黑老虎酸、開環新南五味子酸A含量均較高的產地為廣西防城港（0.076、0.964 mg/g），較低的為廣東佛岡（0.001、0.235 mg/g）。

3 討論

3.1 HPLC色譜條件的優化

3.1.1 流動相的確定 比較了甲醇-水、乙腈-水及在流動相中添加一定濃度的磷酸等流動相組成，使用甲醇-水、乙腈-水系統進行洗脫，各峰的對稱性和分離度差；而使用甲醇-0.1%磷酸水溶液系統進行洗脫，各峰的保留時間較長；以乙腈-0.1%磷酸水溶液系統為流動相進行洗脫，被分析物的峰對稱性好，分離度滿足要求，保留時間也較理想。故實驗選用乙腈-0.1%磷酸水溶液系統作為流動相。

3.1.2 檢測波長的選擇 將三萜酸混合對照品溶液注入HPLC儀器，應用DAD檢測器在190～400 nm波段掃描，再與單組份對照品溶液相對照，發現兩種三萜酸組分的最大紫外吸收波長均為200 nm；但在此波長下，溶劑末端吸收較嚴重，基線不夠理想。為提高信噪比，保證基線平穩，消除噪音對定量分析的影響，故選擇210 nm為檢測波長。

3.2 供試品溶液制備方法的優化

考察了甲醇、75%甲醇、95%乙醇等提取溶劑，結果顯示，3種提取溶劑的提取量不存在顯著性差異；因此，選擇安全系數較大的95%乙醇作為提取溶劑。比較了采用95%乙醇超聲提取30、45、60 min 的效果，結果顯示，30 min的提取率低于45 min的提取率，而45、60 min的提取量不存在顯著性差異，因此選擇95%乙醇超聲提取45 min作為制備供試品溶液的方法。

3.3 小結

實驗測定了8個不同產地黑老虎藥材中12-乙酰氧基黑老虎酸和開環新南五味子酸A的含量，結果顯示，不同產地藥材中兩種三萜酸的量之間均存在明顯差異，可能與藥材采收時間、儲藏時間、生長年限以及生長環境等因素有關，具體原因有待于進一步研究。

本研究首次建立了HPLC法同時測定黑老虎藥材中12-乙酰氧基黑老虎酸和開環新南五味子酸A等兩種三萜酸類成分的量，方法簡便、準確、穩定性好，為黑老虎藥材質量控制提供了一定的參考。

[參考文獻]

[1] 中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京：科學出版社，1996：252-261.

[2] 廣東省中藥材標準編輯委員會.廣東省中藥材標準[M].廣州：廣東科技出版社，2004：188-189.

[3] 舒永志，成亮，楊培明，等.黑老虎的化學成分及藥理作用研究進展[J].中草藥，2011，42（4）：805-813.

[4] 梁忠厚，范適，宋光桃，等.黑老虎的研究進展[J].湖南生態科學學報，2017，4（3）：52-56.

[5] 李賀然.新型羊毛甾烷類化合物、其制備方法及抗癌用途：中國，CN101607886A[P].2009-12-23.

[6] 楊銳培，王潔，王德勤，等.黑老虎栽培技術及其混偽品鑒定研究進展[J].安徽農業科學，2018，46（8）：26-28.

[7] 劉乘風，李少軍，楊彥輝.野生黑老虎人工種植技術研究[J].林業與生態，2017（12）：33-34.

[8] 梁忠厚，李有清.湖南低海拔地區黑老虎引種試驗研究[J].湖南生態科學學報，2018，5（1）：28-31.

[9] 李艷，陳駿，黎開燕，等.冷飯團的抗炎作用及其機制研究[J].現代中西醫結合雜志，2014，23（25）：2745-2747.

[10] 王來友，王鳳云，王集華，等.壯藥黑老虎根提取物對大鼠非酒精性脂肪肝病的作用及機制[J].廣東藥學院學報，2015，31（6）：1-4.

[11] 方靈芝.黑老虎的化學成分及抗氧化活性研究[D].天津：南開大學，2013.

[12] 舒永志，成亮，曺濬喆，等.黑老虎的化學成分研究[J].中草藥，2012，43（3）：428-431.

[13] 王楠，李占林，劉曉秋，等.黑老虎根化學成分的研究（Ⅱ）[J].中國藥物化學雜志，2012，22（4）：305-309.

[14] 延在昊，成亮，孔令義，等.黑老虎化學成分及其抗氧化活性研究[J].中草藥，2013，44（21）：2969-2973.

[15] 王楠，李占林，華會明.黑老虎根化學成分的研究[J].中草藥，2010，41（2）：195-197.

[16] Wang N，Li ZL，Song DD，et al. Lanostance-type triterpenoids from the roots of Kadsura coccinea [J]. Nat Prod，2008，71（6）：990-994.

[17] 陸俊，劉如如，趙雪萌，等.黑老虎活性成分及生理活性研究進展[J].食品研究與開發，2018（2）：219-224.

[18] 石柳柳，李賀然.黑老虎中倍半萜類化合物的分離鑒定及抑制NO生成作用研究[J].中國醫藥導報，2016，13（10）：27-29.

[19] 宋琰，朱勇喆，趙慶杰，等.12-乙酰氧基黑老虎酸在制備防治丙型肝炎病毒藥物中的應用：中國，CN103961-357A[P].2014-08-06.

[20] Lian-Niang L，Hong X，Da-Lun G，et al. Isolation and Structure Elucidation of Seco-neokadsuranic Acid A and 3，4-Seco-（24Z）-lanosta-4（30），8，24-triene- 3，26-dioic Acid 1 [J]. Planta medica，1989，55（3）：300-302.