HIF-2α和Twist2在乳腺癌中的表達及其與預后的關系

劉瓊雯，李秋雨，孫松，李惠翔

（鄭州大學第一附屬醫院 病理科，河南 鄭州 450052）

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤。缺氧微環境是惡性腫瘤浸潤和轉移的始動因素，缺氧誘導因子-2α（hypoxia-inducible factors, HIF-2α）是為適應缺氧而衍生出的一種堿性-螺旋-環-螺旋（basic-helixloop-helix, bHLH）-PAS蛋白家族轉錄因子，對促進血管生成、調節增殖凋亡及誘導侵襲轉移至關重要[1-2]。Twist2也稱為Dermo1，參與腫瘤細胞上皮-間質轉化，是癌細胞獲得遷徙、侵襲及轉移能力的主要因子之一。有研究表明，Twist2是HIF-2α的特異靶基因之一[3]。本實驗將進一步探討兩者在乳腺癌中的表達及與預后的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年8月-2012年1月鄭州大學第一附屬醫院病理科存檔的乳腺組織石蠟標本143例。其中，乳腺非特殊浸潤性癌92例作為乳腺癌組，癌旁正常組織30例作為癌旁正常組織組，纖維腺瘤21例作為纖維腺瘤組。92例乳腺癌組織來源于女性，年齡27～83歲，中位年齡47.50歲，平均年齡49.51歲；組織學分級I級11例，Ⅱ級62例，Ⅲ級19例；TNM分期Ⅰ期6例，Ⅱ期7例，Ⅲ期78例，Ⅳ期1例；伴有腋窩或鎖骨下淋巴結轉移者51例，未見轉移者41例?；颊咝g前均未行放化療及內分泌治療，手術切除標本經甲醛固定、石蠟包埋及切片染色，并由2位病理醫生進行閱片及分類。

1.2 試劑

鼠抗人HIF-2α單克隆抗體（ab8365）及鼠抗人Twist2單克隆抗體（ab57997）購于美國Abcam公司，免疫組織化學檢測試劑盒（SP-9000）及濃縮型二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine,DAB）試劑盒購于北京中杉金橋有限公司。

1.3 免疫組織化學染色

免疫組織化學染色運用過氧化物酶標記的鏈霉卵白素SP三步法，具體步驟如下：石蠟切片脫蠟、梯度酒精水化，抗原高壓熱修復、阻斷及封閉，滴加一抗4℃過夜（HIF-2α單克隆抗體1∶2 000、Twist2單克隆抗體1∶200），滴加生物素標記的通用二抗及鏈霉卵白素-過氧化物酶，DAB染色、蘇木精復染，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。本實驗以PBS替代一抗作陰性對照，已知陽性的乳腺癌切片作為陽性對照。

1.4 判定標準

在光鏡下呈現棕黃色細顆粒狀物質即為顯色，HIF-2α蛋白陽性染色主要定位于胞核，部分胞漿中也可見，Twist2蛋白陽性染色主要定位于胞漿。在高倍鏡（10×40）下對每張切片隨機選擇8～10個視野進行計數，染色強度從無色到淺黃、棕黃及棕褐色分別計0～3分；陽性細胞數從0%、＞0%～10%、＞10%～25%、＞25%～50%、＞50%分別計0～4分；將染色強度和陽性百分比相乘，所得數值＞3即為陽性表達[4]。

1.5 隨訪

患者的生存結局經查閱病歷、電話等形式獲得，從術后第1天開始計算到患者死亡或末次隨訪止為總生存時間，隨訪日期截止到2016年12月31日，最長隨訪時間59個月，平均隨訪時間為44.78個月，中位隨訪時間為47.00個月。

1.6 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計學軟件，計數資料以率（%）表示，比較用χ2或Fisher檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗，相關性分析用Pearson法，影響因素的分析用Cox比例風險回歸模型，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組的HIF-2α、Twist2蛋白表達

乳腺癌組、癌旁正常組織組及纖維腺瘤組HIF-2α蛋白陽性率分別為71.73%、36.66%和42.85%，其中92例乳腺癌中，HIF-2α陰性（-）26例（28.26%），弱陽性（+、++）49例（53.26%），強陽性（+++）17例（18.47%）。3組HIF-2α表達陽性率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），乳腺癌組高于纖維腺瘤組和癌旁正常組織組。3組Twist2蛋白陽性率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），乳腺癌組高于纖維腺瘤組和癌旁正常組織組。見表1和圖1、2。

2.2 各臨床病理特征乳腺癌患者的HIF-2α、Twist2陽性率比較

不同腫瘤大小、有無淋巴結轉移乳腺癌患者的HIF-2α陽性率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。不同組織學分級、有無淋巴轉移及雌激素受體乳腺癌患者的Twist2陽性率比較，經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表1 各組HIF-2α、Twist2蛋白的比較

圖1 各組HIF-2α蛋白的表達 （SP×200）

圖2 各組Twist2蛋白的表達 （SP×200）

表2 各臨床病理特征乳腺癌患者的HIF-2α、Twist2陽性率比較

續表2

2.3 乳腺癌組中HIF-2α、Twist2蛋白表達的相關性

乳腺癌組中HIF-2α、Twist2蛋白均陽性表達35例（38.04%），均陰性表達14例（15.22%），HIF-2α蛋白陽性而Twist2蛋白陰性患者5例（5.43%），HIF-2α蛋白陰性而Twist2蛋白陽性患者9例（9.78%），乳腺癌中HIF-2α與Twist2的表達呈正相關（r=0.452，P=0.000）。

2.4 HIF-2α、Twist2蛋白表達與乳腺癌患者預后的關系

乳腺癌HIF-2α、Twist2蛋白陰性患者5年生存率分別為96.1%和89.2%，乳腺癌HIF-2α、Twist2蛋白陽性患者5年生存率分別為80.3%和78.6%，HIF-2α、Twist2蛋白陰性與陽性患者5年生存率比較，差異有統計學意義（χ2=5.599和5.515，P=0.018和0.023），兩者均為影響乳腺癌預后的因素。無論HIF-2α還是Twist2蛋白，其陰性患者生存曲線均較平緩，相對于陽性患者擁有更高的5年生存率及更長的生存期。見圖3、4。

將年齡、腫瘤大小、分級、分期等因素納入Cox比例風險回歸模型中，多因素生存分析顯示，淋巴結轉移、HIF-2α陽性和腫瘤直徑＞2 cm可作為乳腺癌患者預后的影響因素（P＜0.05）。見表3。

圖3 乳腺癌HIF-2α陽性與陰性患者的生存曲線

圖4 乳腺癌Twist2陽性與陰性患者的生存曲線

表3 乳腺癌患者預后影響因素的Cox多因素分析

3 討論

HIF-2α是20世紀90年代末提取出來的細胞因子，包涵bHLH-PAS結構域成分[5]。HIF-2α和最先在人類基因組中發現且研究較為普遍的缺氧誘導因子-1α在結構上有48%的氨基酸序列同源性。可被缺氧環境誘導表達，在腎透明細胞癌、胰腺癌及肝癌等眾多腫瘤中異常表達，且與腫瘤的發生發展、侵襲轉移及生存預后均存在關聯[6-9]。Twist2也稱為Dermo1，該細胞因子的主要作用之一是與真皮發育相關，在進化過程中高度保守，Twist蛋白家族是一種含有bHLH結構的轉錄因子，Twist2和Twist1相比，其結構相似性高達66%，但是兩者的功能尚不一致[10]。Twist2在多數非癌組織中呈低表達或不表達，而在眾多實體瘤中呈高表達，并參與細胞上皮間質轉化過程，是癌細胞發生浸潤轉移的主要影響因素之一[11]。HIF-2α和Twist2均歸屬于bHLH-PAS家族成員，Twist家族是HIF-2α的特異靶基因，兩者參與調控細胞增殖分化、新生血管形成、腫瘤增殖和轉移等過程[12]。研究顯示，缺氧微環境及HIFs介導的眾多低氧信號通路在誘發上皮間質轉化（epithelial- mesenchymal transition,EMT）過程中起到了關鍵作用[13]。YANG等[14]研究發現，HIF-2α在胰腺癌EMT中起關鍵作用，通過介導Twist2對E-cadherin進行下調而引發EMT，從而引起腫瘤侵襲轉移。HIF-2α可以促進體外癌細胞遷移侵襲，并調節E-cadherin和基質金屬蛋白酶的表達，對EMT的發生和進行至關重要。ZHOU等[15]發現高轉移性囊腺癌細胞HIF-2a和Twist2的表達均高于低轉移性囊腺癌細胞，唾液腺囊腺癌HIF-2a和Twist2陽性表達與腫瘤周圍神經侵犯、局部復發和遠處轉移均密切相關，并推測缺氧環境與EMT之間存在相關性。

淋巴結轉移是明確的判斷乳腺癌預后指標之一，乳腺癌中HIF-2α和Twist2蛋白的陽性表達提示患者預后不良。HIF-2α可能通過Twist2介導乳腺癌細胞的上皮間質轉化，促進腫瘤轉移，縮短生存期。HIF-2α和Twist2有可能作為乳腺癌預后判斷和靶向治療的生物學標志物。