好要湯對雌性小鼠卵巢功能的影響

鐘宇富　劉國洪　杜英娟　時軍

【摘 要】 目的：考察好要湯對雌性小鼠卵巢功能的影響。方法：給藥后對雌性小鼠的陰道角化上皮細(xì)胞、子宮和卵巢的體重及指數(shù)、孕酮P的含量、卵巢和子宮的形態(tài)學(xué)等方面觀察。結(jié)果：與空白組比較，好要湯中、高劑量組（4.5、6.8 g/kg）均能不同程度地延長雌性小鼠的動情期，角化上皮細(xì)胞陽性率明顯升高，好要湯高劑量組（6.8 g/kg）能增大小鼠的卵巢指數(shù)，提高血清孕酮P含量，明顯增加黃體數(shù)目。結(jié)論：好要湯有防止卵巢衰老功效。

【關(guān)鍵詞】 好要湯；排卵；陰道角化上皮細(xì)胞；孕酮P

【中圖分類號】R-332 【文獻標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）12-0035-05

Abstract：Objective To investigate the effect of Haoyaotang powders on ovary function of female mice. Methods The vaginal keratinocyte， the weight and index of uterus and ovary， the content of progesterone P， the morphology of ovary and uterus in female mice were observed after administration. Results Compared with the blank group， medium and high dose group of Haoyaotang powders（4.5、6.8 g·kg-1） can significantly prolong estrus in female mice， the positive ratio of keratinized epithelial cells increased significantly， high dose group of Haoyaotang powders（6.8 g·kg-1） can increase the ovarian index， enhance the content of serum progesterone P and increase the number of corpora luteum of female mice. Conclusion Haoyaotang powders can anti-age the ovarian of female mice.

Keywords：Haoyaotang Powders； Ovary Function； Keratinized Epithelial Cells； Progesterone P

好要湯具有緩解勞累、促進產(chǎn)后恢復(fù)的功能，源于婦科臨床補腎強腰方，含覆盆子、黃精、玉竹、酸棗仁等中藥，具有益氣扶正、補肝腎的功效，可緩解體力疲勞，提高人體精力，預(yù)防早衰，促進人體各項功能恢復(fù)[1]。研究通過觀察給藥后對雌性小鼠的陰道角化上皮細(xì)胞、子宮和卵巢的體重及指數(shù)、孕酮P的含量、卵巢和子宮的形態(tài)學(xué)等方面的變化，考察好要湯的促排卵功效，為其科學(xué)合理運用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Honour Intrument Shaker歐諾搖床（天津市歐諾儀器儀表有限公司）；Top Pette8-Channer Pipettor移液排槍（大龍興創(chuàng)實驗儀器（北京）有限公司）；MNT-150美耐特原點數(shù)顯卡尺（上海美耐特實業(yè)有限公司）；OLYMPUS CKX41倒置式生物顯微鏡（北京中儀光科科技發(fā)展有限公司）；ELX800通用酶標(biāo)儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.2 藥物與試劑 好要湯（批號：170521，廣禾堂草本科技（上海）有限公司）；定坤丹（批號：139170102，山西廣譽遠(yuǎn)國藥有限公司）；孕酮P試劑盒（上海通蔚實業(yè)有限公司）；4%多聚甲醛固定液（批號：20160314，武漢谷歌生物科技有限公司）。

1.3 動物 SPF級昆明種小鼠，雌雄兼用，體質(zhì)量18～22 g，南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號SCXK（粵）2016-0041，廣東藥科大學(xué)實驗動物中心飼養(yǎng)實驗。

2 方法

2.1 分組及給藥 取雌性小鼠75只，隨機為5組，空白組，定坤丹組，好要湯低、中、高劑量組，適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，根據(jù)體重逐只給藥，連續(xù)給藥15 d。空白組灌胃生理鹽水，陽性組選用定坤丹，給藥量為臨床等效量（1.62 g/kg），好要湯高劑量組（6.8 g/kg，臨床等效量的1.5倍），好要湯中劑量組（4.5 g/kg，臨床等效量），好要湯低劑量組（3 g/kg，臨床等效量的0.67倍）。

2.2 陰道角化上皮細(xì)胞檢查[1] 于給藥第10 d后每日上午9時，各組小鼠每日陰道涂片1次。將無菌棉簽用生理鹽水浸濕后插入小鼠陰道，充分蘸取分泌物后取出，在玻片上輕輕滾動，使分泌物均勻地涂布于玻片上，自然風(fēng)干，以新配制的5%美藍(lán)溶液（95%乙醇溶液配制）染色，2 h后用水漂去多余染色液，待干，置于生物顯微鏡下觀察陰道角化上皮細(xì)胞的情況，連續(xù)涂片1個動情周期（5 d）。以角化上皮細(xì)胞面積大于涂片總面積的50%作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，計算陽性率[2]。

2.3 血清中孕酮P水平檢測 末次給藥1 h后，各組小鼠均用摘眼球法取血，將所取血液靜置2 h后，離心（3000 r/min，10 min），分離血清，按照試劑盒說明書操作。測定小鼠血清中孕酮P的含量。孕酮P酶聯(lián)免疫分析（ELISA）的具體操作步驟如下：①標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 μL。②加樣：分別設(shè)置空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加帶測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不要觸及孔壁，輕輕晃動混勻。③加酶：每孔用移液排槍加酶標(biāo)試劑100 μL，除空白空外。④溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。⑤配液：用20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。⑥洗滌：小心揭開封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。⑦顯色：每孔先加顯色劑A 50 μL，再加顯色劑B 50 μL，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。⑧終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立即轉(zhuǎn)藍(lán)色）。⑨測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD）值。測定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進行。⑩計算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出直線回歸方程式，根據(jù)樣品的OD值算出相應(yīng)的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度[3-4]。

2.4 子宮、卵巢指數(shù)測定末次給藥1 h后，摘眼球取血后迅速將小鼠處死，剖開腹腔，取出子宮和兩側(cè)卵巢，剝離周圍組織和脂肪，迅速以電子天平稱量子宮和卵巢的濕重。換算成臟器指數(shù)：子宮指數(shù)=子宮重量（mg） /100 g體重，卵巢指數(shù)=卵巢重量（mg） /100 g體重。

2.5 子宮和卵巢組織形態(tài)學(xué)檢查將所取的新鮮子宮和卵巢組織標(biāo)本以4%多聚甲醛固定液固定，常規(guī)脫水，浸蠟包埋，切片，HE染色。生物學(xué)顯微鏡檢并攝像，觀察組織形態(tài)學(xué)變化，并記錄雙側(cè)卵巢切片中各級卵泡總數(shù)和黃體數(shù)目。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對陰道上角化細(xì)胞的影響 空白組小鼠在涂片的5 d內(nèi)，動情前期、動情期、動情后期和動情間期的周期性變化比較明顯，可觀察到角化上皮細(xì)胞數(shù)量和白細(xì)胞數(shù)量呈反比的規(guī)律性變化。其余組表現(xiàn)為陰道脫落細(xì)胞性周期延長、不規(guī)則，在采樣時間內(nèi)可觀察到陰道涂片上出現(xiàn)成片或團塊的角化上皮細(xì)胞，只有少量的白細(xì)胞。定坤丹組、好要湯中劑量組和高劑量組均能不同程度地延長雌性小鼠的動情期，角化上皮細(xì)胞大于50%的陽性率與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P <0.05或P <0.01）。定坤丹組和好要湯高劑量組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

3.2 對血清中孕酮P含量的影響 與空白組比較，好要湯組（3、4.5、6.8 g/kg）能不同程度地升高小鼠血清中孕酮P含量；好要湯高劑量組（6.8 g/kg）與空白組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見圖1、表2。

3.3 對子宮和卵巢形態(tài)、臟器指數(shù)及各級卵泡總數(shù)的影響

3.3.1 對小鼠體重、臟器指數(shù)的影響 好要湯（3、4.5、6.8 g/kg）組與空白組比較，體重?zé)o明顯變化，子宮重量有所增加，子宮指數(shù)稍大，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；好要湯高劑量組與空白組比較，卵巢重量明顯增加，卵巢指數(shù)明顯增大，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。好要湯（3、4.5、6.8 g/kg）組與定坤丹組比較，小鼠體重、子宮重量、子宮指數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；好要湯中、低劑量組與定坤丹組比較，卵巢重量偏小，卵巢指數(shù)偏低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）；好要湯高劑量組與定坤丹組比，兩者卵巢重量和卵巢指數(shù)均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），即高劑量的好要湯能增大小鼠的卵巢重量和卵巢指數(shù)。見表3。

3.3.2 對子宮和卵巢形態(tài)的觀察 由子宮切片（見圖2）和卵巢切片（見圖3）可得，空白組子宮腔內(nèi)膜上皮厚度較薄，腺腔輕度擴張，血管較少；卵巢體積稍小，色澤蒼白，卵泡結(jié)構(gòu)不清，或囊泡呈原始狀態(tài)。卵巢皮質(zhì)部可見不同發(fā)育階段的卵泡，可見少量黃體和白體形成，未見囊性卵泡，可見適量脂滴。好要湯（3、4.5、6.8 g/kg）組與空白組比較，子宮外觀粗大發(fā)紫，宮腔內(nèi)膜上皮變厚，腺腔擴張，可見核下空泡，間質(zhì)疏松；卵巢色澤更鮮艷，卵泡明顯增大，卵泡未見明顯的囊性擴張、細(xì)胞變形、壞死炎細(xì)胞浸潤等病變；髓質(zhì)未見充血、水腫及炎細(xì)胞浸潤。表面見較多黃體，黃體的顆粒細(xì)胞發(fā)育良好，形態(tài)完整，排列整齊緊致[5]。

3.4 對卵巢中各級卵泡總數(shù)和黃體數(shù)目的影響 由表4可知，好要湯（3、4.5、6.8 g/kg）組與空白組相比，卵泡總數(shù)有明顯增加的趨勢，但兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；好要湯低劑量組、中劑量組與空白比較，黃體數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），高劑量組（6.8 g/kg）與空白組比較，黃體數(shù)目明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表4。

。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為，腎虛主要體現(xiàn)在腰膝酸痛、腿軟、耳鳴耳聾、齒發(fā)脫落、失眠多夢、潮熱盜汗、性功能減退、女子經(jīng)少、經(jīng)閉或卵巢早衰等方面，其癥狀與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論中疲勞或慢性疲勞綜合征的癥狀基本一致，都是人生理機能衰退的表現(xiàn)[6-7]。因此，緩解體力疲勞、提高精力、養(yǎng)生保健及防止衰老等，都可從補養(yǎng)腎精腎氣入手調(diào)理[8]。傳統(tǒng)中醫(yī)藥重視調(diào)動人體自身的免疫力，達(dá)到抗疲勞能力，在對抗疲勞，提高精力，抗衰老方面有著得天獨厚的優(yōu)勢，同時具有安全有效，毒副作用小的特點。因此，研發(fā)出具有毒副作用小、療效良好、可長期服用的中藥功能食品，將具有較大的市場發(fā)展?jié)摿Α?/p>

好要湯可延長雌性小鼠的動情期，明顯升高角化上皮細(xì)胞陽性率，增大小鼠的卵巢指數(shù)，提高孕酮P含量，明顯增加黃體數(shù)目，闡釋了好要湯方溫補腎陽的現(xiàn)代科學(xué)內(nèi)涵[8]。

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（收稿日期：2018-04-13 編輯：程鵬飛）