替諾福韋酯治療多重耐藥的乙型肝炎肝硬化患者療效初步研究*

陳欣，陳立冬，李庭紅

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的慢性肝炎。據統計，15%～49%CHB會轉變成肝硬化和肝癌[1]。CHB的發病機制復雜，病毒的持續復制和免疫功能紊亂是發病的重要因素。核苷（酸）類似物（nucleoside/nucleotide analogues，NAs）是治療乙型肝炎肝硬化（liver cirrhosis，LC）的一線藥物，但隨著多種NAs的上市和廣泛使用，HBV耐藥率也逐漸升高。有研究報道，拉米夫定作為早期被批準用于治療CHB的NAs，治療第1、2、3、4年HBV耐藥率分別為14%、38%、49%、66%[2]。不同NAs聯合治療還會出現雙重或多重耐藥[3]。替諾福韋酯（tenofovir disoproxil fumarate，TDF）于2008年被美國食品藥品管理局批準用于治療CHB。國外多項研究證實，TDF用于初治代償期乙型肝炎肝硬化患者，可長期有效地抑制HBV復制，改善患者生物化學和組織學指標，且安全性和耐受性良好。2015年美國肝病協會和亞太肝病研究學會發布的CHB防治指南均將TDF推薦為NAs耐藥患者的一線治療藥物。TDF于2014年6月在我國正式上市，對于我國多重耐藥的乙型肝炎肝硬化患者治療的有效性及安全性尚缺乏循證醫學的證據證明。本研究應用TDF和恩替卡韋（entecavir，ETV）治療了80例多重耐藥的乙型肝炎肝硬化患者，先將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年10月～2016年6月本院診治的多重耐藥的乙型肝炎肝硬化患者80例，男性47例，女性33例；年齡29～57歲，平均年齡（40.5±8.6）歲。病程5～16年，平均病程（7.6±3.2）年。符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年版）》診斷標準[4]，并經血生化、病毒學和影像學檢查確診，其中HBV基因B型25例，C型52例，未分型3例；血清HBeAg陽性16例；代償期肝硬化62例，失代償期18例。納入標準：初始選擇拉米夫定（lamivudine，LAM）治療，其后發生病毒耐藥，再選擇阿德福韋酯（adefovir，ADV）、替比夫定（telbivudine，LdT）或恩替卡韋（entecavir，ETV）單藥序貫治療，再次發生耐藥者，其中對LAM和ADV雙重耐藥者55例，對LAM、ADV和LdT三重耐藥者22例，對LAM、ADV和ETV三重耐藥者3例。排除標準：①重疊其他肝炎病毒或艾滋病病毒感染；②合并酒精性肝炎、自身免疫性肝病或肝癌者；③伴有嚴重的心、腦、腎或血液系統疾病者；④對本研究所使用藥物過敏者；⑤妊娠或哺乳期婦女。采用隨機數字表法將80例（對LAM、ADV和LdT三重耐藥）患者分為TDF治療組和ETV治療組，每組40例，兩組性別、年齡、病程和病情等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經醫院醫學倫理委員會批準通過，患者簽署知情同意書。

1.2 治療方法 兩組入組后均給予TDF【葛蘭素史克（天津）有限公司，國藥準字H20050651】300 mg隨餐口服，1次/d，持續治療12 w；隨后，在TDF組繼續給予TDF治療，而在ETV組則改為ETV（中美上海施貴寶制藥有限公司，國藥準字H20052237）1 mg口服，1次/d，觀察兩組48 w。

1.3 觀察指標 使用日本OLYMPUS AU5400全自動生化分析儀檢測血肌酐（serum creatinine，sCr）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）和磷（phosphorus，P+）；使用美國 Roche LightCycler 480II 實時熒光定量PCR儀定量檢測血清HBV DNA；對于病毒學突破者，采用PCR產物直接測序法進行耐藥基因檢測；采用ELISA法檢測HBV血清標志物（美國雅培公司生產的i2000R免疫發光檢測系統及其試劑）；使用法國Echosens公司生產的FibroScan502型瞬時彈性掃描儀檢測肝硬度值；采用ELISA法檢測血清成纖維細胞生長因子-23（fibroblast growth factor，FGF-23，美國 BioRad 公司，BioRad450 酶標儀）；采用免疫透射比濁法檢測血清胱抑素-C（cystatin-C，Cys-C）、β2- 微球蛋白（β2-microglobulin，β2-MG）和視黃醇結合蛋白（retinol binding protein，RBP，上海遠慕生物科技有限公司）。

1.4 統計學方法 應用SPSS 21.0軟件包對數據進行統計學分析，計量資料以（±s）表示，采用t或F檢驗；計數資料采用x2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血生化學和病毒學應答率比較 在治療12 w，兩組ALT復常率和HBV DNA陰轉率比較，差異無統計學意義（P＞0.05），而在治療24 w和48 w時，TDF組ALT復常和病毒學應答率顯著高于ETV組，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）。

表1 兩組生化學和病毒學應答率（%）比較

2.2 兩組肝功能指標和肝硬度值變化的比較 在治療24 w和48 w時，TDF組肝功能指標顯著好于ETV組，差異有統計學意義（P＜0.05，表2）。

2.3 安全性和耐藥情況 在治療48 w，兩組血清FGF-23、Cys-C、β2-MG、RBP、sCr和 P+水平差異無統計學意義（P＞0.05，表3）；在治療過程中，TDF組出現病毒學突破1例（2.5%），對PCR產物直接測序未提示TDF耐藥。在ETV組，出現病毒學突破2例（5.0%），對PCR產物直接測序提示ETV耐藥1例，存在rtT184位點突變。

表2 兩組肝功能指標和肝硬度值（±s）變化的比較

表2 兩組肝功能指標和肝硬度值（±s）變化的比較

與ETV組比，①P＜0.05

例數 TBIL（μmol/L） ALT（IU/L） ALB（g/L） Child-Pugh評分（分） 肝硬度值（kPa）TDF組 治療前 40 28.9±4.2 154.9±34.5 31.2±1.2 8.7±1.3 22.4±3.2治療 12 w 40 22.4±4.0 88.9±19.4 32.4±1.5 8.5±1.3 19.4±3.1 24 w 40 16.0±3.1 67.4±16.8① 33.4±2.0 7.4±1.2① 17.3±2.7①48 w 40 14.3±2.9 45.6±10.4① 35.2±1.9① 6.3±1.1① 14.5±2.5①ETV組 治療前 40 29.4±4.5 153.6±35.6 31.3±1.4 8.6±1.4 22.7±3.3治療 12 w 40 23.7±4.2 90.5±20.1 32.1±1.5 8.4±1.3 20.1±3.1 24 w 40 20.5±4.6 77.4±18.3 32.2±1.7 8.2±1.4 19.4±3.2 48 w 40 17.4±3.0 58.7±11.4 33.5±2.0 7.9±1.2 17.5±2.8

表3 兩組腎功能指標和細胞因子水平（±s）比較

表3 兩組腎功能指標和細胞因子水平（±s）比較

例數 FGF-23（pg/ml） Cys-C（mg/L） β2-MG（mg/L） RBP（mg/L）TDF組 治療前 40 224.4±35.3 2.3±0.3 2.9±0.4 38.8±6.3治療 48 w 40 235.7±36.5 3.1±0.4 3.4±0.5 42.6±7.2 ETV組 治療前 40 225.8±35.9 2.4±0.3 3.1±0.3 39.1±6.9治療 48 w 40 233.6±34.6 3.2±0.5 3.4±0.4 41.3±6.8 sCr（μmol/L）88.7±12.1 91.8±11.3 88.9±12.4 90.4±12.0 P+（mmol/L）1.4±0.3 1.1±0.2 1.3±0.3 1.2±0.2

3 討論

NAs因具有口服方便、抗病毒作用強、不良反應少、安全性好等優點而在抗病毒治療CHB患者方面占據重要的地位。但由于NAs的廣泛使用及使用時間較長，耐藥率逐年升高。目前，世界各類指南及專家共識均認為使用強效、沒有交叉耐藥的抗病毒藥物是NAs耐藥后挽救治療的主要原則。

TDF是替諾福韋的酯前藥物，口服后很快水解為替諾福韋，其抗病毒機制為經腸道吸收進入細胞后，在磷酸激酶的作用下成為活性二磷酸，可與HBV DNA合成所需的5’-三磷酸脫氧腺苷酸競爭性結合HBV DNA反轉錄酶而抑制HBV DNA合成[5]。TDF對HBV復制的抑制作用具有高效性，可使HBeAg陽性或陰性的CHB患者迅速獲得完全病毒學應答。有研究報道，在81例LAM耐藥患者，經替換ADV治療后有32例發生對ADV耐藥，49例對LAM或ADV不完全應答，給予TDF治療6個月和12個月時病毒學應答率分別為68.2%和75.9%[6]。在一項多中心回顧性分析研究發現，給予153例對LAM耐藥的CHB患者TDF或LdT治療，12月后兩組病毒學應答率分別為92.6%和78.4%，TDF組HBeAg轉陰率和ALT復常率也高于LdT組（P＜0.05）[7]。進一步研究發現，基線HBV DNA＜1×103IU/mL時容易達到完全病毒抑制。本研究兩組患者均對NAs耐藥，部分患者發生雙重甚至三重耐藥，給予TDF治療12周再分組，結果TDF組治療24周和48周，上述指標均優于ETV組。

大量研究證實，HBV的持續復制及耐藥病毒株的產生是引起肝纖維化和肝癌的獨立危險因素[8，9]。2015年亞太肝病研究學會CHB指南將TDF推薦為乙型肝炎肝硬化的一線藥物，國外已有多項研究證實TDF在代償期乙型肝炎肝硬化患者可長期有效地抑制HBV復制，改善患者生物化學和組織學指標，延緩LC進程。對于HBV相關性慢加急性肝衰竭和肝硬化患者，給予TDF治療48周，隨著HBV DNA 載量的下降，肝功能顯著改善[10，11]。TDF可改善肝功能Child-Pugh評分，降低肝硬度值。本研究治療24周和48周后，隨著HBV DNA載量的下降，TDF組肝功能指標和肝硬度值水平均顯著下降，與有關報道[12]相符。

在TDF上市前，美國肝病學會和歐洲肝病學會將對HBV有強效抑制作用且具有高耐藥基因屏障的ETV推薦為一線藥物[13]。國內外對于LAM耐藥的患者，在挽救治療時不少采用ETV序貫方案[14，15]。但隨著ETV的廣泛使用，ETV耐藥毒株的檢出率也開始顯現。2015年美國肝病協會和亞太肝病研究學會發布的CHB診治指南建議，對于ETV治療失敗的CHB患者，可加用或單用TDF治療，可降低耐藥率。有人進行為期5年的研究觀察，用TDF作為NAs耐藥的挽救用藥，結果5年耐藥發生率僅為2.5%，且目前尚未檢測出對TDF的耐藥基因[16]。研究發現，含有rtA181V和rtN236T基因的LAM或ADV耐藥株可使對TDF的易感性下降3.2～4.0倍，但這種不足可被大劑量的TDF克服[17]。本研究在治療過程中，TDF組有1例出現病毒學突破，但經PCR產物直接測序未提示對TDF耐藥。

TDF主要經腎小球過濾和腎小管主動轉運系統排泄，約70%～80%以原形經尿液排出體外[18]，長期服用有腎功能不全和低磷酸鹽血癥發生的危險。如何預防和降低TDF對腎功能及磷代謝的影響是臨床醫師關注的熱點問題。Cys-C、β2-MG和RBP是監測早期腎功能損傷的敏感指標，而FGF-23是機體的重要調磷因子。在一項應用TDF治療CHB患者的長期觀察中發現，血清Cys-C、β2-MG和RBP水平分別于服用TDF 24周、32周和48周首次出現升高，適當調低TDF劑量后可恢復正常[19]。服用TDF 56周后出現FGF-23升高，調低TDF劑量后FGF-23也恢復正常[20]。本研究在治療48周后兩組 FGF-23、Cys-C、β2-MG、RBP、sCr 水平略高于治療前，但差異無統計學意義（P＞0.05），在治療過程中也無患者出現sCr升高至≥2 mg/dL和血P+＜2 mg/dL的情況，提示應用TDF治療乙型肝炎肝硬化患者對腎功能和血P+的影響還是輕微的，需進一步隨訪。