慢性丙型肝炎和肝硬化患者外周血Th17和Treg細胞及其相關細胞因子水平變化*

周思思，沈有秀，李娟，俞科賢

據報道，70%～80%HCV感染會發展為慢性肝病，其中約20%可進展為肝硬化（liver cirrhosis，LC），甚至肝癌[1]。輔助性T淋巴細胞17（ helper T lymphocytes 17，Th17） 和調節性 T淋巴細胞（regulatory T lymphocytes，Treg）是新型 T 淋巴細胞亞群，具有促炎和抗炎的雙重能力[2]。相關研究發現，Th17/Treg細胞比值失衡和細胞分子水平異常可促使肝炎病毒感染向慢性化發展，加重肝組織免疫炎癥反應[3]。本研究檢測了慢性丙型肝炎（CHC）和丙型肝炎肝硬化患者外周血Th17和Treg細胞及其相關細胞因子水平，以探討它們變化的臨床意義，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2014年10月～2016年10月本院收治的CHC患者33例，男17例，女16例；年齡16～50歲，平均年齡（36.35±4.28）歲。丙型肝炎肝硬化患者27例，男13例，女14例；年齡26～61歲，平均年齡（46.82±6.32）歲。符合慢性丙型肝炎防治指南的診斷標準[4]，經影像學檢查診斷LC，Child-Pugh評分≥7分。排除乙型肝炎、酒精性肝病、脂肪性肝病、惡性腫瘤、精神病史和合并HIV感染患者。另選同期在本院健康體檢者30例作為對照組，男16例，女14例；年齡17～63歲，平均年齡（45.91±6.23）歲。受試者簽署知情同意書，本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。

1.2 治療方法 對CHC患者，給予α-干擾素聯合利巴韋林（PR）治療方案，即給予聚乙二醇干擾素α-2a（派羅欣，上海羅氏制藥有限公司，國藥準字J20120075）180 μg皮下注射，1 次 /w，利巴韋林（江西匯仁藥業股份有限公司，國藥準字H20033538）300 mg口服，3次/d。治療12 m，根據《丙型肝炎防治指南》（2004版）的藥物應用指導原則調整劑量和治療療程。

1.3 外周血Th17和Treg細胞及其細胞因子水平檢測 清晨，采集空腹靜脈血10 mL，采用ELISA法檢測白介素 -6（interleukin-6，IL-6）、IL-10、IL-17和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β，美國Market公司）；使用美國Beckman公司提供的流式細胞儀及其檢測Th17和CD4+CD25+Foxp3+Treg一步法試劑盒檢測血Th17和Treg細胞數。

1.4 統計學處理 應用SPSS 22.0統計軟件處理數據，計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，兩兩均數的比較采用LSD-t檢驗。計數資料以（%）表示，采用x2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組外周血Th17和Treg細胞數比較 LC和CHC患者外周血Th17和Treg細胞比率和Th17/Treg比值顯著高于健康人，差異有統計學意義（P<0.05）；LC患者外周血Th17和Treg細胞比率和Th17/Treg比值顯著高于CHC患者，差異有統計學意義（P<0.05，表1）。

表1 三組外周血Th17和Treg細胞（±s）比較

表1 三組外周血Th17和Treg細胞（±s）比較

與健康人比，①P<0.05；與CHC患者比，②P<0.05

例數 Th17細胞（%） Treg細胞（%） Th17/Treg比值健康人 30 2.3±0.4 1.7±0.4 1.4±0.2 CHC 33 4.6±0.7① 2.7±0.5① 1.6±0.4①LC 27 5.8±0.9①② 3.1±0.6①② 1.9±0.5①②

2.2 三組血清細胞因子水平比較 LC和CHC患者血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平均顯著高于健康人，差異有統計學意義（P<0.05）；LC患者血清IL-6、IL-10、IL-17和 TGF-β 水平顯著高于 CHC患者，差異有統計學意義（P<0.05，表2）。

表2 三組血清細胞因子水平（ng/L，±s）比較

表2 三組血清細胞因子水平（ng/L，±s）比較

與健康人比，①P<0.05；與CHC患者比，②P<0.05

例數 IL-6 IL-10 IL-17 TGF-β健康人 30 6.7±1.1 14.2±2.9 5.3±0.6 4.3±1.0 CHC 33 9.9±2.5① 18.0±3.2① 15.3±2.8① 5.5±0.8①LC 27 14.1±3.0①② 21.4±4.0①② 23.3±3.9①② 7.2±1.2①②

2.3 CHC患者治療前后外周血Th17和Treg細胞比率及血清細胞因子水平變化的比較 治療后，CHC患者外周血Th17和Treg細胞比率及血清TGF-β、IL-10和IL-17水平均顯著下降，差異有統計學意義（P<0.05，表3）。

表3 CHC患者外周血Th17和Treg細胞比率及血清細胞因子水平（±s）比較

表3 CHC患者外周血Th17和Treg細胞比率及血清細胞因子水平（±s）比較

例數 Th17細胞（%） Treg細胞（%） TGF-β（ng/L） IL-10（ng/L） IL-17（ng/L）治療前 33 4.6±0.7 2.7±0.5 5.5±0.8 18.0±3.2 15.3±2.8治療后 33 3.4±0.6 1.9±0.4 4.7±0.6 15.1±2.5 11.5±2.1 t值 - 7.477 7.177 4.596 4.102 6.237 P值 - <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

3 討論

目前，Th細胞亞群及其相關細胞因子失衡被認為是肝炎病毒感染的主要致病機制，尤其是CD4+T淋巴細胞Th1/Th2細胞失衡方面[5，6]。另有資料顯示，CD4+T淋巴細胞能夠產生影響Th17和Treg細胞分化的細胞因子[7]。Th17是新近發現的T細胞亞群，可分泌IL-17、IL-6、IL-22等細胞因子，進而介導炎癥反應，在自身免疫疾病和機體防御方面意義重大。而Treg作為新型T細胞亞群，可分泌IL-10和TGF-β等細胞因子，調節機體免疫耐受，控制自身免疫反應[8，9]。研究表明，Th17和Treg細胞均可能參與了肝炎病毒感染的進程，并起到重要的作用[10]。

在HCV感染后，機體肝實質細胞會產生并大量釋放胸腺基質淋巴細胞生成素，進而刺激Th17細胞增值和分化，而Th17細胞可分泌IL-17并對肝細胞凋亡形成抑制，促使HCV感染細胞存活，從而造成HCV感染慢性化發展[11-13]。此外，Treg細胞增多可有助于HCV清除，抑制肝纖維化進展[14]，但它還可協同多種細胞因子如TGF-β和IL-10等作用，誘導HCV感染慢性化[15]。研究表明，CHC患者外周血Th17/Treg細胞比例較健康人高，在抗病毒治療后Th17/Treg比例則顯著降低，推測Th17/Treg細胞比值在感染慢性化進程中可能出現了動態變化[16]。本研究顯示，CHC組和LC組外周血Th17、Treg細胞比率和Th17/Treg比值均顯著較對照組高，LC組顯著高于CHC組，差異有統計學意義，有關研究結果[17]相似，提示Th17和Treg細胞在CHC發生發展過程中增加明顯，造成Th17/Treg細胞平衡紊亂，進而加速CHC病情的進展。在相關細胞因子方面，研究表明，IL-17、TGF-β和IL-10水平升高可能是產生肝硬化的重要因素[18]。IL-17可對肝星狀細胞形成起促進作用，在TGF-β的直接作用下，加快肝星狀細胞對細胞外基質的合成速度，引起肝纖維化，而IL-10雖可抑制炎癥反應，但可促使TGF-β合成，進而加重肝纖維化。另有研究表明，血清IL-6水平與肝纖維化關系密切，相關分析顯示IL-6水平與肝炎嚴重程度存在正相關關系[19]，說明細胞因子水平對病毒感染的進展起作用。有資料顯示，IL-17、TGF-β和IL-10等細胞因子水平升高可加速Treg細胞分化，促使丙型肝炎病毒向慢性丙型肝炎發展[20]。健康人血清細胞因子水平最低，而CHC組和LC組則升高，且Th17、Treg細胞比率和各細胞因子水平與肝功能指標存在正相關關系[21]。本研究發現，LC組和CHC組血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平均顯著高于對照組，LC組血清IL-6、IL-10、IL-17和TGF-β水平又顯著高于CHC組，差異有統計學意義，提示Th17、Treg細胞和血清細胞因子水平與CHC或LC發生發展存在一定的關系。Th17細胞可分泌IL-17，可直接作用于肝星狀細胞表面的IL-17R，進而激活肝星狀細胞，分泌更多IL-6，并促使 TGF-β、TGF-α 水平升高[22]，而 Treg細胞分泌的IL-10可形成對中性粒細胞的負性調節，降低對肝細胞的損害，但可抑制HCV特異性T細胞增殖及細胞因子的分泌，其與Th17細胞的分化作用相互排斥[23-25]。故當Th17/Treg比值升高，Th17細胞比率高于Treg細胞時，可反映HCV感染的慢性化進展。此外，有關研究發現，病毒性肝炎患者經抗病毒治療后Treg細胞、Th17細胞和血清IL-17、TGF-β、IL-10和IL-23水平均比治療前顯著降低[26]。本研究數據顯示，CHC患者經抗病毒治療后外周血Th17、Treg細胞比率和血清TGF-β、IL-10和IL-17水平均顯著低于治療前，差異有統計學意義，進一步說明外周血Th17和Treg細胞及其相關細胞因子水平可反映CHC患者病情變化，或許對新治療靶點的探尋以及治療效果的判斷具有一定的臨床指導意義。

本研究病例數較少，觀察時間較短，且為單中心觀察，未對接受抗病毒治療的CHC患者進行不同應答分層比較，故還有待于進一步大樣本的隨訪觀察。