葡萄糖神經酰胺葡萄糖基轉移酶siRNA對7702肝細胞增殖的影響及機制研究*

李俊峰，鄭素軍，劉霜，任鋒，陳煜，段鐘平

在糖鞘脂代謝過程中，葡萄糖化神經酰胺合成酶（glucosy lceramide synthase，GCS）是催化神經酰胺進行糖基化的關鍵酶[1-5]。我們之前的研究均表明鞘脂及其代謝在多種肝臟疾病的發生發展中扮演重要的角色[6-8]。最近我們發現丙型肝炎患者血漿糖化神經酰胺的變化與肝內壞死性炎癥的發生風險明顯相關[9]。我們推測內源性GCS可能與肝細胞的增殖和凋亡有一定的聯系。本研究利用體外siRNA技術干擾GCS基因表達，觀察了肝細胞的增殖和相關凋亡通路的變化，目的在于探討GCS在肝細胞增殖過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞 人源肝細胞株7702細胞為首都醫科大學附屬北京佑安醫院人工肝中心長期保存。RPMI 1640培養基（美國Hyclone公司），10%胎牛血清（美國Hyclone公司），細胞培養箱（美國Thermo公司）。

1.2 siRNA轉染細胞 取對數生長期的7702細胞，每孔取1×105細胞，鋪于24孔板。置于培養箱中培養24 h，待細胞貼壁后棄去上清，每孔加入siRNA和Lipofectamin 2000混合液。同時將無血清無抗生素的1640培養基作為空白對照組，同時將只加轉染試劑的Lipofectamin 2000作為轉染試劑組。培養6 h，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。采用實時熒光定量PCR法檢測UDP-葡萄糖神經酰胺葡萄糖基轉移酶（UDP-glucose ceramide glucosyltransferase，UGCG）siRNA對靶基因GCS的干擾效果。UGCG siRNA 序列為：正向（5’→3’）CGC GAA UCC AUG ACA AUA UTT，反向 （5’→3’）AUA UUG UCA UGG AUU CGC GTT；陰性對照siRNA序列為：正向 （5’→3’）GCGACGAUCUGCCUAAGA UdTdT，反向（5’→3’）AUC UUA GGC AGA UCG UCG UCG CdTdT。人 GCS 引物序列：正向（5’→3’）TTC ATG TGT CAT TGC CTG GC，反向（5’→3’）AGC GTA ATC TGT AGC GAC CA。

1.3 UGCG siRNA對肝細胞增殖的影響 采用MTT法檢測。

1.4 細胞 Bcl-2、Bax和 Caspase 3基因水平檢測 采用實時熒光定量PCR法，取7702細胞1×105個/孔，鋪種于24孔板，加入完全培養基1 mL，培養細胞24 h，待細胞貼壁生長后，分為轉染組和UGCG siRNA干預組，培養6 h，換成無血清培養基，繼續培養至24 h。然后，提取細胞RNA。采用紫外分光光度法測定總RNA濃度及純度，在37℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min 進行反轉錄反應，合成cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測mRNA水平：反應體系為20μl，PCR循環參數為：步驟 1：50℃ 2 min；步驟 2：95℃ 10 min；步驟3：95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個循環。人源 GCS、Bcl-2、Bax和Caspase 3基因引物序列為：人Bcl-2正向 （5’→3’）：GTG GCC TTC TTT GAG TTC GG，反向 （5’→3’）：GGC CGT ACA GTT CCA CAA AG；人 Bax正向（5’→3’）：ATG AAG ACA GGG GCC CTT TT，反向（5’→3’）：GCA ATC ATC CTC TGC AGC TC；人 Caspase 3正向（5’→3’）：ACT GGA CTG TGG CAT TGA GA，反向（5’→3’）：GCACAAAGCGACTGGATGAA；人GAPDH 正向（5’→3’）：CCA GAA CAT CAT CCC TGC CT，反向（5’→3’）：CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG。

1.5 肝細胞Caspase 3蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測，取對數生長期7702細胞，調整細胞密度為3～3.5×105/m1，在wRNA干預組，37℃培養6 h，換成無血清培養基培養至24 h，分離蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。配制12%分離膠10 ml和5%濃縮膠5ml，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉PVDF膜，用5%脫脂奶粉按1:800比例配制兔抗人Caspase-3單克隆抗體，將膜浸于抗體中4℃搖床過夜，用5%脫脂奶粉按1:2000比例配制抗兔二抗，浸膜，室溫下搖床上孵育1 h，將ECL發光試劑A與試劑B以1:1比例混合后，將PVDF膜曝光，掃描分析。應用Image J software 1.46軟件分析條帶灰度值。

1.6 統計分析 應用SPSS 19.0軟件行數據分析，計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 UGCG siRNA對肝細胞轉染的抑制作用 將siRNA和轉染試劑按照不同比例轉染（兩者以VsiRNA:VLipo=3:1的比例轉染，siRNA終濃度為0.12 μmol/L）。將UGCG siRNA和陰性對照siRNA以VsiRNA:VLipo=3:1的比例轉染7702細胞24 h后，采用PCR法檢測siRNA對靶基因GCS基因水平的抑制效果，結果發現轉染UGCG siRNA組相比轉染試劑組，GCS基因水平有明顯被抑制的現象（P<0.05），而轉染陰性對照siRNA組GCS基因水平相對轉染試劑組無明顯變化（圖1）。

2.2 各組細胞增殖率比較 與單獨轉染試劑Lipofec tamin 2000轉染細胞比，轉染UGCG siRNA后肝細胞增殖明顯被抑制（P<0.05，圖2）。

2.3 各組細胞肝細胞凋亡相關分子mRNA水平比較 結果發現相比轉染試劑組，UGCG siRNA轉染組肝細胞Bcl-2 mRNA水平顯著下降（P<0.05），Bax mRNA水平顯著升高（P<0.05），Caspase 3 mRNA水平同樣上調（P<0.05，圖3）。

圖1 各組UGCG siRNA轉染肝細胞后糖化神經酰胺酶mRNA水平比較 表明UGCG siRNA能夠降低GCS基因水平

圖2 各組細胞增殖率比較 表明UGCG siRNA能夠抑制7702肝細胞增殖

圖3 各組細胞肝細胞凋亡相關基因mRNA水平比較 表明UGCG siRNA能夠下調Bcl-2 mRNA水平，上調Bax和Caspase 3 mRNA水平

2.4 各組細胞Caspase 3蛋白表達情況比較 結果發現與轉染試劑組比，轉染UGCG siRNA肝細胞Caspase 3表達量上調（圖4）。

圖4 各組細胞Caspase 3蛋白表達情況 表明UGCG siRNA能夠上調肝細胞Caspase 3蛋白的表達

3 討論

本研究的主要發現為首次驗證了抑制GCS的基因表達可能會導致肝細胞的凋亡。本研究在設計上采用siRNA技術靶向干擾GCS的基因表達，進而在GCS表達特異性抑制的基礎上，探討GCS對肝細胞增殖的影響及其可能的信號通路。由于凋亡信號通路錯綜復雜，因此本文為初步研究，未能觀察GCS基因表達的抑制對其他凋亡信號通路的影響。但是，基于目前的研究結果，我們推測肝細胞內源性GCS可能參與了肝細胞的生長周期。

在鞘脂代謝中，GCS是催化神經酰胺進行糖基化的關鍵酶，通過影響神經酰胺和糖鞘脂的代謝平衡來調控細胞的生理活性。在神經酰胺的糖基化過程中，葡萄糖連接在神經酰胺的1-羥基基團，從而產生葡萄糖神經酰胺[14,15]。GCS是UGCG基因編碼的內在膜蛋白，在所有真核細胞膜上表達。在GCS表達下降或者活性減低時，神經酰胺糖基化水平下降，導致神經酰胺水平升高，升高的神經酰胺是有效誘導細胞凋亡的介質，能夠觸發內源性和外源性細胞凋亡。而神經酰胺激活調控細胞凋亡的主要途徑主要為內質網和線粒體途徑[8]，并參與到TNF α介導的凋亡通路中[16]。本研究首先驗證靶向針對GCS基因的UGCG siRNA序列的干擾效果，發現該UGCG siRNA序列能夠抑制GCS基因的表達，繼而在此前提下，進一步觀察利用siRNA技術特異性抑制GCS的基因表達對肝細胞增殖的影響。結果發現肝細胞的增殖受到明顯抑制，轉染UGCG siRNA的肝細胞活性明顯下降，說明肝細胞的增殖可能與GCS被抑制有關，推測抑制該酶后可能會導致神經酰胺水平升高，進而可能參與到肝細胞活性下降的過程中。

為了更深入研究GCS基因表達被抑制后引起肝細胞凋亡的可能機制，本研究進一步觀察了轉染UGCG siRNA后對肝細胞凋亡相關的Bcl-2凋亡途徑的影響。作為抗凋亡基因，Bcl-2可與Bax形成二聚體，抑制細胞凋亡，而Bax水平增加可拮抗Bcl-2的作用，促進細胞凋亡[17]。此外，研究證實Bax在線粒體膜中形成Bax通道，促進細胞色素C釋放并進入胞質，使Bcl-2與Apaf1分離后，繼而激活Caspase，誘導細胞凋亡[18，19]。因此，Bcl-2 和 Bax在調控細胞凋亡過程中發揮重要作用。本研究發現抑制GCS基因表達后，可以導致Bcl-2基因水平顯著降低，Bax基因水平升高，推測糖化神經酰胺和神經酰胺之間的代謝異常可能參與到Bcl-2和Bax調節的肝細胞凋亡過程中。另外，Caspase 3位于Caspase級聯反應下游，是執行凋亡功能的最主要的蛋白酶之一[20]。本研究發現在抑制GCS基因表達后，Caspase 3基因水平明顯上升，其蛋白表達有上升趨勢，表明可能是由于凋亡相關基因表達改變后，最終引起執行凋亡效應的Caspase 3發生了變化，其蛋白水平上升不是非常明顯，可能是由于效應時間較短的緣故。

總之，本研究在前期研究基礎上，利用siRNA干擾技術體外轉染肝細胞，初步發現GCS基因表達下降后，肝細胞增殖受到抑制，同時細胞凋亡增加，這種效應可能與Bcl-2介導的凋亡過程有關，是各種原因導致GCS發生變化后肝細胞凋亡的機制所在。