桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌糖代謝及GSK-3β表達的影響

（成都醫學院藥學院，四川成都610083）

骨骼肌是機體葡萄糖氧化利用的主要場所，同時也是胰島素作用的主要靶組織之一，對糖尿病的發生發展有重要影響[1]。在骨骼肌細胞中，葡萄糖在己糖激酶（hexokinase，HK）的作用下磷酸化成為葡萄糖-6-磷酸，繼而在其它酶催化作用下生成肌糖原，為肌肉收縮提供能量。在2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）大鼠模型中，出現了肌糖原合成下降[2]，HK活性下降的現象[3]，從而認為骨骼肌中糖原合成的紊亂會引起血中葡萄糖濃度的升高。

糖原合成激酶-3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β）是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可以磷酸化糖原合酶來調控其活性，影響糖原的合成和分解過程。有研究發現，高糖高脂飲食加鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導可使豬骨骼肌GSK-3β mRNA和蛋白表達增加，肌糖原減少，導致骨骼肌胰島素抵抗（insulin resistance，IR）[4]，而抑制 GSK-3β 可以在提高胰島素敏感性和促進胰島β細胞增殖這兩個方面產生潛在的抗糖尿病效果[5]。

桑葉是桑科桑屬植物桑（Morus alba L.）的樹葉，歷代中醫藥書中都有桑葉能夠治療消渴的記載。現代藥理研究證明桑葉總黃酮對T2DM大鼠有降血糖及促進胰島素分泌的作用[6]。此外，我們先前的研究發現，桑葉總黃酮可以增加T2DM大鼠肝臟中肝糖原含量，葡萄糖激酶的活性[7]。在此基礎上，本文針對桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌中肌糖原含量，HK活性及GSK-3β蛋白表達的影響進行了評價，以期進一步完善桑葉總黃酮的降血糖機制，為桑葉總黃酮治療T2DM的臨床應用提供藥理學依據。

1 材料與方法

1.1 動物和飼料

SPF級wistar大鼠85只，雄性，體重200 g～250 g，四川大學華西實驗動物中心提供，許可證號：scxk（川）2009-09。在室溫 20℃～25℃、濕度（55±5）%、光照周期12 h/12 h的環境中飼養。普通飼料：購自四川大學華西實驗動物中心；高脂飼料：按照普通飼料59.8%、白糖15%、豬油10%、食鹽2%、膽固醇0.2%、酪蛋白7%、蛋黃粉5%配制[8]。

1.2 藥品與試劑

桑葉總黃酮：由成都醫學院藥學院實驗中心自行制備，測得樣品中總黃酮含量約為55%[9]；肌糖原試劑盒（批號：20140530）、考馬斯亮藍試劑盒（批號：20140603）、HK 測定試劑盒（批號：201404028）：南京建成生物工程公司；鹽酸二甲雙胍片（批號：201406）：鞍山九天制藥有限公司；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）：Sigma公司；一抗兔抗大鼠GSK-3β單克隆抗體：Cell signaling公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）內參抗體羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG：武漢博士德公司；硝酸纖維膜：Millipore公司；ECL發光試劑：Pierce公司；實驗所用其它化學試劑均為分析純。

1.3 儀器

Forma 905-86℃超低溫冰箱、Micro 21高速冷凍離心機、Varioskan Flash酶標儀：美國Thermo公司；CP225D精密分析天平：德國Sartorious公司；DN2000微量紫外可見分光光度計：美國NanoDrop公司；安穩血糖儀及其血糖試紙：長沙三諾生物公司。

1.4 方法

1.4.1 模型的建立

所有大鼠適應性喂養7天后，隨機選取10只作為正常對照組，給予普通飼料，其余大鼠喂養高脂飼料，14周后，腹腔注射35 mg/kg·bw STZ，誘導T2DM模型。注射后第3天眼眶后靜脈叢采血測空腹血糖，以空腹血糖＞11.1 mmol/L作為造模成功標準。注射后繼續高脂飼料喂養，2周后再測血糖，空腹血糖仍＞11.1 mmol/L證明模型穩定，選入正式實驗[10]。

1.4.2 動物分組

將造模成功的60只大鼠隨機分為5組，即模型組，二甲雙胍組（100 mg/kg·bw），桑葉總黃酮高、中、低劑量組（200、100、50 mg/kg·bw），每組各 12 只，灌胃給藥。正常組及模型組按10 mL/kg·bw灌服生理鹽水。給藥周期為4周。在給藥期間，正常對照組給予標準飼料，其余各組大鼠給予高脂飼料。

1.4.3 口服葡萄糖耐量實驗

在給藥第4周末（第28天），進行一次口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT），即大鼠空腹12 h后，用50%葡萄糖溶液2 g/kg灌胃，眼眶后靜脈叢采血，檢測給糖前即0 h和給糖后0.5、1、2 h的血糖，計算糖耐量曲線下面積（area under concentration curve，AUC），。

式中：G0為給糖前即0 h血糖，mmol/L；G0.5為給糖后0.5 h的血糖，mmol/L；G1為給糖后1 h的血糖，mmol/L；G2為給糖后2 h的血糖，mmol/L。

1.4.4 骨骼肌肌糖原和HK活性的測定

給藥4周結束后，處死大鼠，取各組大鼠右后肢骨骼肌組織，用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干裝于凍存管中-80℃冰箱保存。肌糖原測定時，取骨骼肌組織100 mg勻漿，按照試劑盒方法測定620 nm時各組大鼠肌糖原的含量。HK活性測定時，稱取200 mg骨骼肌組織，加生理鹽水制成10%的勻漿液，離心，取上清液按試劑盒所附方法進行實驗。

1.4.5 骨骼肌組織GSK-3β蛋白含量測定

稱取30 mg骨骼肌組織（剔除筋膜、脂肪等組織），以組織重量（g）∶裂解液體積（mL）=1∶10的比例加入裂解液，同時加入蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、1 mmol/L苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）各3 μL，電動勻漿器以20 000 r/min轉速勻漿，上清液測定蛋白濃度，取20 ug煮沸變性5 min。然后經10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳，電轉移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，在 3%的牛血清白蛋白（albumin from bovine serum，BSA）溶液中4℃振搖封閉30 min，洗膜后加入兔抗大鼠GSK-3β單克隆抗體（1∶1500）4℃振搖過夜，再用辣根過氧化物酶標記二抗室溫孵育1 h。洗膜后加ECL發光試劑，在ChemiDoc化學發光凝膠成像檢測儀中進行光密度掃描。應用管家基因GAPDH作為蛋白上樣量對照，其余組與其相比得到相對量。

2 統計學方法

應用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD），方差不齊采用 Dunnett’s T3法。計量資料用±s表示。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果與分析

3.1 桑葉總黃酮對T2DM大鼠血糖和AUC值的影響

桑葉總黃酮對T2DM大鼠血糖和AUC值的影響結果見表1。與正常對照組相比，模型組大鼠各時間點的血糖值和AUC值均極顯著上升（P均＜0.01）。與模型組比較，不同劑量的桑葉總黃酮組的各個時點的血糖值均有所降低，其中以高劑量組降低極顯著（P均＜0.01）。桑葉總黃酮高、中、低組的AUC值較模型組均極顯著降低（P均＜0.01）。

表1 桑葉總黃酮對T2DM大鼠血糖和AUC值的影響（±s）Table 1 Effect of total flavonoids of mulberry leaves on blood glucose and AUC of T2DM rats（±s）

表1 桑葉總黃酮對T2DM大鼠血糖和AUC值的影響（±s）Table 1 Effect of total flavonoids of mulberry leaves on blood glucose and AUC of T2DM rats（±s）

注：與正常對照組相比，##P＜0.01，極顯著；與模型組比較，*P＜0.05，顯著，**P＜0.01，極顯著。

3.2 桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌中肌糖原和HK活性的影響

桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌中肌糖原和HK活性的影響結果見表2。

表2 桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌肌糖原和HK活性的影響（±s）Table 2 Effect of total flavonoids of mulberry leaves on muscle glycogen and the activity of hexokinase in the skeletal muscle of T2DM rats（±s）

表2 桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌肌糖原和HK活性的影響（±s）Table 2 Effect of total flavonoids of mulberry leaves on muscle glycogen and the activity of hexokinase in the skeletal muscle of T2DM rats（±s）

注：與正常對照組相比，##P＜0.01，極顯著；與模型組比較，*P＜0.05，顯著，**P＜0.01，極顯著。

經桑葉總黃酮干預治療后，高劑量組肌糖原的含量較模型組明顯增加（P＜0.05），而高、中劑量組骨骼肌中HK的活性較模型組極顯著增加（P均＜0.01）。

3.3 桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌中GSK-3β蛋白表達的影響

桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌中GSK-3β蛋白表達的影響結果見圖1，表3。

圖1 桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌中GSK-3β蛋白表達的影響Fig.1 Effect of total flavonoids of mulberry leaves on the expression of GSK-3β protein in the skeletal muscle

與正常對照組相比，模型組大鼠骨骼肌中GSK-3β蛋白表達極顯著升高（P＜0.01）。經桑葉總黃酮干預治療后，高、中劑量組的GSK-3β蛋白表達較模型組顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）。

表3 桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌中GSK-3β蛋白表達的影響（±s）Table 3 Effect of total flavonoids of mulberry leaves on the expression of GSK-3β protein in the skeletal muscle of T2DM rats（±s）

表3 桑葉總黃酮對T2DM大鼠骨骼肌中GSK-3β蛋白表達的影響（±s）Table 3 Effect of total flavonoids of mulberry leaves on the expression of GSK-3β protein in the skeletal muscle of T2DM rats（±s）

注：與正常對照組相比，##P＜0.01，極顯著；與模型組比較，*P＜0.05，顯著，**P＜0.01，極顯著。

4 討論

目前有關研究顯示，餐后，胰島素介導的葡萄糖攝取的主要部位是在骨骼肌，85%的葡萄糖被骨骼肌利用，因此，骨骼肌在維持葡萄糖的代謝系統起著至關重要的作用[12]。T2DM患者體內存在的IR，進而導致骨骼肌中的葡萄糖穩態受損[13]。我們的研究顯示，與模型組相比，桑葉總黃酮高劑量組對T2DM大鼠各個時點的血糖值均有所降低，較低的0.5 h血糖值說明桑葉總黃酮可以緩減血糖值的升高，較低的1 h血糖值說明桑葉總黃酮可以降低血糖峰值，較低的2 h血糖值說明桑葉總黃酮可以降低餐后2 h血糖值。總的來說，桑葉總黃酮可以改善T2DM大鼠的血糖升高，維持血糖的正常代謝。

在骨骼肌細胞中，葡萄糖在HK的作用下磷酸化為葡萄糖-6-磷酸（G-6-P），G-6-P在磷酸葡萄糖變位酶的作用下轉變成1-磷酸葡萄糖，而后生成尿苷二磷酸葡萄糖（uridine diphosphate glucose，UDPG），UDPG在糖原合酶GYS1的作用下生成肌糖原。T2DM患者骨骼肌中的糖原含量明顯低于正常人群。目前研究表明，某些藥物可通過增加糖尿病大鼠骨骼肌中HK活性促進肌糖原的合成貯存，減少血液中游離的葡萄糖，促使T2DM大鼠血糖降低[14-15]。我們的研究顯示，桑葉總黃酮能增加T2DM大鼠骨骼肌中的HK活性，增加肌糖原含量，提示桑葉總黃酮降低血糖的機制可能與增加骨骼肌中糖的利用和貯存有關。

GSK-3是糖原合成的限速酶之一，調控細胞的葡萄糖轉運及糖原合成。在胰島素抵抗和T2DM患者骨骼肌中，過度表達的GSK-3可能導致胰島素受體底物-1（insulin receptor substrate 1，IRS-1）磷酸化，減弱IRS-1信號的傳導，從而導致骨骼肌細胞膜上的葡萄糖轉運體-4（glucose transporters 4，GLUT-4）轉位減少，葡萄糖轉運減少。因此，使用一些高選擇性抑制劑GSK-3可增加骨骼肌中葡萄糖的轉運從而提高胰島素的活性[16]。GSK-3β是GSK-3的亞型之一，在調節骨骼肌糖原合酶活性、肌糖原合成中起著關鍵作用[17]。有研究發現，糖原合酶 1（glycogen synthase 1，GYS1）的活性是被GSK-3β調節的，若GSK-3β被磷酸化，則GYS1失活[18]。在骨骼肌GSK-3β基因特異性敲除的動物模型中，糖耐量升高，空腹及餐后肌糖原含量顯著升高，胰島素敏感性降低[19-20]。因此，合適的GSK-3β抑制劑會在T2DM治療中發揮很大的作用[21]。我們的研究顯示，經桑葉總黃酮干預治療后，大鼠骨骼肌中GSK-3β蛋白表達較模型組顯著降低。說明桑葉總黃酮可能通過抑制骨骼肌中GSK-3β蛋白表達而治療T2DM。

綜上所述，我們的實驗顯示桑葉總黃酮可以增加T2DM大鼠骨骼肌HK的活性，降低GSK-3β蛋白的表達，從而增加大鼠骨骼肌中肌糖原含量而降低血糖。桑葉總黃酮作為一種天然產物，在改善T2DM患者血糖升高，維持血糖的正常代謝方面具有一定的應用開發潛力。