微生物分解技術在環境保護中的應用研究

郭海燕

摘要：黑曲霉可以在四環素菌渣發酵中產生一系列酶，促進菌渣中的蛋白、纖維素、多糖等物質的分解。本研究用液體培養基培養黑曲霉種子接種于四環素菌渣發酵體系中，有效發揮了黑曲霉在菌渣處理體系中的作用，優化了處理效果，促進四環素菌渣處理規模化，減少環境污染，實現資源的循環利用，保護環境。

Abstract： Aspergillus niger can produce a series of enzymes in the fermentation of tetracycline slag， promoting the decomposition of proteins， cellulose， polysaccharides and other substances in the slag. In this study， the Aspergillus niger seeds were inoculated into the tetracycline slag fermentation system by liquid culture medium， which effectively played the role of Aspergillus niger in the slag treatment system， optimized the treatment effect， promoted the scale treatment of tetracycline slag treatment， and reduced environmental pollution， realizing the recycling of resources and protecting the environment.

關鍵詞：黑曲霉；四環素菌渣；發酵；液體培養

Key words： Aspergillus niger；tetracycline slag；fermentation；liquid culture

中圖分類號：X172 文獻標識碼：A 文章編號：1006-4311（2018）29-0238-03

0 引言

黑曲霉具有多種活性較強的酶系，如纖維素酶、淀粉酶、酸性蛋白酶等，可將原料中的纖維素、蛋白質等大分子化合物降解轉化為易消化利用的養分，并為酵母菌等提供必需的糖、氨基酸等營養物質，黑曲霉和酵母菌在同一個發酵體系內混種培養可以協同作用，相互促進生長，尤其酵母菌生長比較旺盛。在四環素菌渣發酵中加入黑曲霉和酵母菌混合培養，發酵效果明顯好于酵母菌純種降解菌渣，氨基氮水平高于純種培養體系，氨基酸含量有明顯升高，發酵過程中泡沫明顯減少，發酵結束后發酵液具有酵母芳香氣味。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

15L種子罐；50L發酵罐；高效液相色譜儀；奧林巴斯CX31拍照顯微鏡。

啤酒酵母冷凍液（自保藏）；

黑曲霉固體斜面孢子（自保藏）。

1.2 測定方法

1.2.1 氨基酸測定方法

高效液相色譜法

色譜條件（表1）。

色譜柱：Aglient C18柱，流動相A ：8g/L無水醋酸鈉（pH7.2）-四氫呋喃-三乙胺（994：6：0.2）；流動相B：甲醇-乙腈-4g/L無水醋酸鈉（pH7.2）（450：350：200）。

1.2.2 氨基氮測定方法

甲醛滴定法：稱取樣品5g（精確至0.002g），加水溶解定容至100mL。吸取樣品溶液5.0mL于100mL燒杯中，加入55mL水，用0.05mol/L的氫氧化鈉標準滴定溶液滴定至pH=8.20，并保持1min不變，此結果為游離酸度，不予計量體積，慢慢加入36%甲醛溶液10mL，放置1min后，用氫氧化鈉標準溶液滴定至pH=9.20，記錄消化氫氧化鈉標準滴定溶液的毫升數。同時做空白試驗，記錄加入甲醛溶液后，空白試驗所消耗氫氧化鈉標準溶液滴定溶液的毫升數。

氨基氮的含量按式（1）計算，其數值以%表示。

1.3 實驗方法

四環素菌渣發酵采用二級發酵方式，用種子罐分別培養黑曲霉和酵母菌，增值酵母菌數量和黑曲霉菌絲量，將一定種齡的種子液移入菌渣發酵培養基中，按一定條件培養。

①酵母菌種子液培養方法：將活化酵母種液按1-3%的接種量接種到如下培養基中：蛋白胨2.0%、酵母浸膏1.0%、葡萄糖2.0%。

培養條件：溫度30-31℃，通氣比1：0.5L/L/min，培養60-70hr移入菌渣培養基中。

②黑曲霉種子液液體培養方法：將黑曲霉孢子懸浮液按1-3%的接種量接種到如下培養基中：蛋白胨0.5%，磷酸二氫鉀0.1%，酵母浸粉0.2%，硫酸鎂0.05%，葡萄糖2.0%。

培養條件：溫度34-35℃，通氣比1：0.5L/L/min，培養60-70hr移入菌渣培養基中。

③酵母純種菌渣發酵方法：將①的種子液按接種量5-10%接種到如下培養基中：四環素菌渣80-85%，葡萄糖0.5%。

培養條件：溫度30℃，通氣比1：0.5L/L/min，培養120hr結束培養。

④黑曲霉和啤酒酵母混種發酵方法：將①和②的種子液混合接入菌渣培養基中，接種量各5-10%，菌種培養基及培養條件同③。

2 結果與討論

2.1 四環素菌渣中的營養物分析

四環素發酵菌渣中含有豐富的營養成分，主要為未利用完的大分子碳源氮源，如淀粉、黃豆餅粉等，還有菌絲自溶釋放的營養物質，如微量元素、菌體蛋白、小分子營養物等，在四環素菌渣發酵中可以作為酵母或黑曲霉的營養物質被分解利用，而無需添加更多的營養成分。

2.2 在菌渣發酵中酵母、黑曲霉混種發酵的優勢分析

2.2.1 四環素菌渣經酵母菌和黑曲霉混合發酵后，培養液有濃郁的酵母香味，顯微鏡鏡檢有大量的酵母菌，發酵料液較單獨使用酵母菌發酵的料液稀薄，但酵母量明顯增多，表明發酵體系中加入黑曲霉時，菌渣中的大分子淀粉、黃豆餅粉等殘留物被分解利用，料液粘度較低，酵母量增值較快。

隨著發酵培養基中淀粉和黃豆餅粉的殘留物被分解，黑曲霉的生長逐漸減弱，速效物質被酵母菌充分利用，生長速度加快，發酵體系中酵母菌越來越多，黑曲霉逐漸由于營養物質匱乏而逐漸失去生長能力，發酵結束時發酵料液中幾乎沒有黑曲霉菌絲。而在酵母菌純種培養的菌種發酵體系內，四環素碎片較多，培養基中雜質明顯多于混種培養體系。

2.2.2 菌渣發酵放罐時料液中的氨基酸含量分析

菌渣發酵后氨基酸的增長是菌渣處理的關鍵指標，氨基酸含量越高說明菌渣的處理效果越好，氨基酸的貢獻主要由酵母破壁后釋放得到，考察游離氨基酸含量即可分析判斷酵母生長量及四環素菌渣的分解狀況。

如表3，發酵體系中接入黑曲霉發酵結束時氨基酸總和高于酵母純種培養時的40%以上，各種氨基酸釋放比較完全，氨基酸種類沒有減少，發酵料液氣味芳香。

2.2.3 發酵過程中的氨基氮變化規律

發酵過程的氨基氮變化規律表現了菌渣分解過程的動態平衡，在黑曲霉和酵母混合培養體系中，發酵前期隨黑曲霉對大分子氮源的分解氨基氮逐漸升高，發酵中期酵母菌利用氮源繁殖生長，氨基氮上升趨勢緩慢，在發酵結束時營養物質匱乏，酵母菌自溶破壁，氨基酸大量釋放，氨基氮有明顯的上升趨勢。但在酵母菌純種培養體系內，發酵前期氨基氮的增長緩慢，大分子氮源分解利用速度較慢，發酵結束時氨基氮水平低于混種培養，酵母菌含量明顯少于混種培養。如圖1。

2.3 結論

據文獻報道，黑曲霉在液體發酵過程中可以分泌蛋白酶和纖維素酶，在菌渣發酵體系中黑曲霉與酵母混合培養，黑曲霉產生的纖維素酶和蛋白酶分解菌渣中的大分子碳氮源，營養物結構發酵改變，可以促進酵母菌的生長。酵母菌在混合培養體系內生長速度較快，酵母含量高，酵母破壁后可以釋放大量的有機物，提高了菌渣二次發酵后的料液質量。

從以上分析結果看，菌渣發酵采用黑曲霉和啤酒酵母混種發酵時，氨基酸含量和氨基氮含量明顯高于酵母純種發酵，抽樣檢查發酵料液中核苷酸含量也高于純種發酵。所以在菌渣發酵處理體系中引入黑曲霉混種發酵效果顯著，發酵料液質量有明顯提高，菌渣處理比較徹底，發酵后固含量殘留減少，效果明顯。這種處理方式，能最大程度的減少固體菌渣排放，對環境的影響作用降到了最低。而且分解處理后產生的氨基酸類物質，可循環利用作為氮源回用于發酵或做飼料，既減少了環境污染，又產生了新的效益和價值。

參考文獻：

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