阿卡波糖結構類似物組分A形成機制研究及其制備

許樂義

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阿卡波糖結構類似物組分A形成機制研究及其制備

許樂義

（杭州中美華東制藥有限公司，浙江 杭州 310000）

對形成阿卡波糖結構類似物組分A的相關機制進行了初步探究，并對其克級樣品的制備進行了首次嘗試。通過對實驗數據的分析，形成組分A的主要原因來自于阿卡波糖的異構化，而且該過程對于菌絲體的參與并不依賴。針對于這一發現，建立了對阿卡波糖進行異構化反應，從而獲得組分A的獲取方法，并通過不斷試驗得到了使組分A達到最高獲得率的條件數據。通過對中性氧化鋁以及強酸型陽離子交換的層析，從異構化的反應液中獲得了高純度的組分A，為發酵液中雜質組分A的去除分離等后續系統的研究提供了材料。

阿卡波糖；結構類似物；發酵液；脫色專用樹脂

本文對形成雜質組分A的機制進行嘗試性的解析，并在此基礎上，對如何制備組分A進行方法探究并建立相應規則，以期獲得組分A在克級上的標本，對于發酵液中雜質組分A的去除分離等后續系統的研究提供了材料。

1 材料和方法

1.1 材料和設備

試驗研究所需要的材料包括阿卡波糖、相關填料、中性層析氧化鋁、WD-脫色專用樹脂、色譜純已腈等；所需要的儀器設備主要包括高效液相色譜儀、高壓層析系統等。這些材料都可通過采購獲得。

1.2 組分A的制備

1.2.1 pH值因素

分別采用定量的HC1溶液和NaOH溶液用以對阿卡波糖溶液的pH值進行調節，以使配置出來的阿卡波糖溶液是標準的。配置好標準溶液之后，在設定好的外界輔助條件的配合下，對其進行異構反應，并在過程中進行取樣，以便于對阿卡波糖的含量和雜質A的含量進行檢測。

1.2.2 溫度因素

僅使用NaOH溶液對阿卡波糖溶液進行pH值調節，調節至一定的pH值之后，在設定好的外界輔助條件的配合下，對其進行異構反應，并在過程中進行取樣，以便于對阿卡波糖的含量和雜質A的含量進行檢測。

1.3 組分A的分離

1.3.1 Macro-prcp High S柱層析

在層析柱中填充一定的強酸型陽離子交換樹脂，設定標準的床體積，并將其在高壓層析系統上進行固定。用超純水對填充柱進行充分平衡后，以相應的流速將定量、經過樹脂進行脫色和微濾處理過的轉化液泵入強酸型陽離子交換樹脂填充柱中；進行樣本化，并用超純水對其進行淋洗，直至基線趨于平穩；用HC1溶液對其進行繼續洗脫，并對洗脫液進行收集，分析洗脫液中各成分的組成及其相應含量。

1.3.2 中性氧化鋁柱層析

通過濕法的方法，將中性氧化鋁的粉末按照一定量的標準裝進層析柱中，設定標準的床體積，并將其在高壓層析系統上進行固定。經超純水對填充柱進行充分的平衡之后，以相應的流速將定量的上述洗脫液泵入相應的中性氧化鋁的填充柱中；進行樣本化，并用超純水對其進行淋洗，直至基線趨于平穩；使用超純水對其進行繼續洗脫，并對洗脫液進行收集，分析洗脫液中各成分的組成及其相應含量。

1.3.3 冷凍干燥

經過上述過程得到洗脫液后，對其中含有較高組分A的洗脫液進行合并，然后通過減壓濃縮的方式去除部分水分，并按照標準對其進行相應時長的冷凍，最后通過對其進行冷凍干燥的方法，獲得組分A的樣品。

1.4 分析方法

1.4.1 對阿卡波糖進行測定的方法

利用水膜對樣品進行微濾之后，對其進行相應檢測，檢測按照相應的標準進行。

1.4.2 對組分A進行測定的方法

檢測按照歐洲藥典的標準進行。

2 結果與討論

2.1 通過異構化反應對組分A進行制備

2.1.1 LC-MS分析

在標準設定條件下，對阿卡波糖溶液進行一段時間的處理；在反應液中會有4類物質生成，將其分別標注為Ⅰ類物質、Ⅱ類物質、Ⅲ類物質、Ⅳ類物質。通過對反應液進行液質聯用分析后發現，殘留在反應液中的阿卡波糖的相對分子量等同于Ⅳ類物質的相對分子量，由此證明Ⅳ類物質為阿卡波糖的同分異構體。同時，在出峰時間上進行對比發現，相比于阿卡波糖，組分A是其0.9倍，并對保留時間進行參考比較，得出了Ⅳ類物質即為雜質組分A的結論。這也從側面論證了形成組分A的原因之一就是阿卡波糖的異構化反應，且在此過程中，可能并不依賴于菌絲體參與。

2.1.2 阿卡波糖異構化反應中pH值的影響

經大量實驗表明，pH值對反應液中通過阿卡波糖異構化的作用生成組分A在效率上有明顯的影響。通過對實驗數據的分析觀察到，當pH等于11時，通過異構化的反應可獲得最多的組分A，并在3 h內異構化的反應趨于平衡，如圖1所示；當pH等于12時，對于組分A的初反應的形成速度是最快的，但反應過程隨著時間的延長，組分A的含量出現逐步下降的情況，同時，Ⅰ類物質、Ⅱ類物質、Ⅲ類物質的生成含量相比于其他處理組織也呈現出明顯增多的現象。由此可以確定，在阿卡波糖異構化的反應過程中，pH值應設定為11.

圖1 pH對阿卡波糖異構化反應的影響

2.1.3 異構化的反應過程中溫度的影響

經過大量的實驗數據表明，在一定的設定溫度區間內，隨著溫度的升高，對阿卡波糖的異構化反應用于生成組分A這一過程越來越有利，并對其反應速度也有明顯的加速提升作用。這一溫度區間為30～70 ℃，通過對實驗數據的線性化曲線表現不難發現，當溫度達到60 ℃之后，曲線趨于平穩，溫度對反應過程的影響開始變小。同時，對反應過程中生成的Ⅰ類物質、Ⅱ類物質、Ⅲ類物質進行了溫度影響的研究。研究數據表明，隨著溫度的升高，Ⅰ類物質、Ⅱ類物質、Ⅲ類物質的生成不斷加快，其中，Ⅱ類物質受溫度影響的變化最為明顯，同樣，對其相應的實驗數據進行線性化，得到其二維曲線圖。經過對比發現，在設定60 ℃和70 ℃溫度條件下，對于生成的組分A的含量進行觀察，發現組分A的含量進本持平，但是在對2個溫度下生成的3種雜質含量進行對比時發現，60 ℃下的生成量低于70 ℃下的生成量，由此可以確定，在阿卡波糖異構化的反應過程中，60 ℃為最優反應設定溫度。

2.1.4 異構化的反應過程中菌絲體的影響

經實驗研究表明，在設定的標準外界輔助環境中，通過阿卡波糖的異構化反應獲得組分A的這一反應能夠實現自發進行，但是存在著其異構化反應不是非常明顯的情況。通過在反應液中分別添加菌絲體以及菌絲體裂解液，從而達到對轉化阿卡波糖這一過程的促進作用，但這一方法對生成組分A的影響微乎其微。除此之外，對pH值進行調整發現，當pH等于11時，對通過阿卡波糖的異構化反應生成組分A這一反應有明顯的強化作用。

2.2 對組分A的提取

2.2.1 Macro-prcp High S柱層析

由于組分A與阿卡波糖為同分異構體，因此，阿卡波糖所含有的阿卡維基機構其同分異構體的組分A也同樣具有，在理論層面上，對組分A也同樣能夠通過陽離子交換樹脂的方法實現吸附分離。試驗中，通過使用強酸型陽離子交換劑實現對阿卡波糖以及組分A的吸附；采用HC1溶液洗脫的方法對其進行處理。經過對實驗的觀察以及對結果的分析發現，組分A具有較弱的結合樹脂的能力，最先被洗脫，隨后Ⅰ類物質、Ⅱ類物質、Ⅲ類物質被洗脫。利用離子交換層析的方法實現對Ⅰ類物質、Ⅱ類物質的去除，并使Ⅲ類物質的含量降低，從而獲得去除雜質的只包含阿卡波糖和組分A的洗脫液，但是這一方法不能夠實現對阿卡波糖和組分A的分類。

2.2.2 中性氧化鋁柱層析

通過利用中性氧化鋁與組分A空間結構不同的原理，嘗試利用中性氧化鋁層析柱實現對阿卡波糖以及組分A分離，效果明顯。實驗結果表明，這一方法可以有效地實現對阿卡波糖以及組分A的分離以及純度的提高。通過強酸型陽離子交換層析、中性氧化鋁層析方法分步驟實現了對組分A的樣品提取，為后續其相關研究提供了基礎材料。

3 結束語

本文通過結合理論實驗以及對大量實驗數據的分析，得到了制備阿卡波糖結構類似物組分A的制備原理，并獲得了相應的克級樣本，為組分A的分類去除提供了參考，為組分A的制備提供了理論依據，為組分A的后續研究工作提供了樣本。

［1］王亞軍，董方智，于蕾，等.陽離子交換樹脂SAC 001×7對阿卡波糖的吸附性能研究［J］.高校化學工程學報， 2012（03）：493-498.

［2］梁現蕊，張會晨，何小媛，等.阿卡波糖中雜質的分離富集方法研究［J］.浙江工業大學學報，2017（03）：49-50.

2095－6835（2018）18－0136－02

TQ920.1

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2018.18.136

〔編輯：張思楠〕