CD8陽性T細胞亞群在肺癌外周血的檢測及分析

丁露,夏云紅,王為民,姚榮杰,孟曼

(合肥市第二人民醫院腫瘤內科，安徽 合肥 230000)

人體免疫功能與肺癌的發生、發展及轉移有著相當密切的關系[1]，當人體出現免疫功能下降甚至免疫缺陷時，腫瘤發病率會明顯增高。免疫衰老與T淋巴細胞表型及功能密切相關，當機體逐漸衰老時，初始型T細胞比例出現降低，而記憶型T細胞逐漸增加，其中以CD8+T細胞的改變較為明顯[2]，而免疫衰老同某些惡性腫瘤發生相關，因此對CD8+T細胞亞群的檢測具有十分重要的意義。本研究擬通過檢測正常人群及肺癌患者外周血中CD8+CD57+T細胞水平的變化，評估其臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料采集2015年4月至2016年5月入住合肥市第二人民醫院明確診斷為肺癌的初次治療患者30例，其中男性患者21例，女性患者9例，年齡范圍39～79歲，年齡(56.0±14.3)歲;TNM分期(UICC，第7版)Ⅲ期12例，Ⅳ期18例。病理類型腺癌15例，鱗癌8例，小細胞肺癌7例。所有患者均經細胞學或病理學證實。所有患者均經過全身化療2周期后，以實體瘤療效評價標準(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors,RECIST)評價療效，按緩解組(完全緩解+部分緩解)和未緩解組(穩定+進展)進行分組，其中緩解組13例，未緩解組17例。健康對照組取自本院門診體檢健康者，共35例，其中男性19例，女性16例，年齡范圍35～70歲，年齡(55.0±15.7)歲。所有入組患者及健康對照組人群均排除其他腫瘤、無風濕免疫性疾病，且未使用激素等免疫抑制劑。本研究獲合肥市第二人民醫院倫理委員會批準，所有患者或近親屬均簽署知情同意書。

1.2試劑與儀器采用CD8-PE、CD28-FITC、CD57-FITC單克隆抗體試劑購自美國Beckman-CouLter公司，流式細胞儀系美國Beckman-CouLter公司產品。

1.3檢測方法分別采集肺癌患者周期性化療前后及健康對照組清晨空腹靜脈血2 mL，加入EDTA抗凝管后搖勻。取抗凝全血100 μL，各加入熒光標記單克隆抗體20 uL混勻，設相應同型對照。避光室溫孵育30 min后，加入1%草酸銨2 mL，充分搖勻，孵育10 min；離心(1 500 r·min-1，10 min)棄去上清，每管加入PBS洗滌液500 μL后離心10 min(1 500轉)，棄去上清，重復2次，加入100 μL PBS混勻后，應用流式細胞儀檢測，采用BDFACSDiva軟件分析獲取細胞，樣品于6 h內檢測。

2 結果

2.1肺癌組患者血清中T細胞亞群表達與健康對照組的比較30例肺癌患者血清中CD8+CD28+T細胞表達水平低于健康對照組人群，而肺癌患者血清中CD8+CD57+T細胞表達水平顯著高于健康對照組人群，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 肺癌患者與健康對照組外周血T細胞亞群的表達水平

2.2經治療后不同療效的肺癌患者與健康對照組T細胞亞群水平的比較肺癌患者經含鉑類藥物為基礎的兩周期化療后，緩解組患者血清中CD8+CD28+及CD8+CD57+T細胞水平與健康對照組相近，差異無統計學意義(P>0.05)，而未緩解組患者血清中CD8+CD28+及CD8+CD57+T細胞水平與健康對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 不同療效肺癌患者與健康對照組外周血T細胞亞群表達水平

2.3不同病理學類型及臨床分期肺癌患者T細胞亞群比較對于不同病理類型肺癌患者，其CD8+CD28+及CD8+CD57+T細胞水平差異無統計學意義(P>0.05)，隨著臨床分期增加，CD8+CD57+T細胞表達程度亦差異無統計學意義(P>0.05)，而CD8+CD28+T細胞水平隨之逐漸增加，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同病理類型及臨床分期的肺癌患者T細胞亞群水平的檢測結果

3 討論

腫瘤的發生、侵襲過程中，承擔自身免疫功能的淋巴細胞發揮了重要作用，是構成機體細胞免疫的重要因素之一[3]。反應免疫功能的細胞表型CD抗原是重要標志，并且會隨著疾病的轉歸發生相應變化。機體對腫瘤細胞的免疫反應大多是由CD8+T細胞主導完成的。而肺癌患者細胞免疫功能的下降，常導致肺癌病情加重甚至死亡。

CD8+T細胞即細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)，在宿主抗病毒和抗腫瘤等免疫應答中發揮重要作用。CD28分子是T細胞中最主要的共刺激分子，為T細胞活化提供第二信號，通常CD28在CTL表達水平約為50%，而當發生多種疾病時，CTL上CD28表達下降[4]。機體抗腫瘤免疫應答時，需CD28與B7相互作用產生第二信號才可使T細胞活化，活化的CD4+細胞分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子，由CD8+細胞毒性免疫細胞發揮直接殺傷，以防止形成克隆無反應狀態。當CD28表達下降時，可能對CD4+及CD8+細胞的活化和增殖有著直接影響，因而造成機體對腫瘤免疫力下降，導致腫瘤的發生。有文獻報道[5-7]CD8+CD28+T細胞表達水平在多種腫瘤中下降，張曉倩等[8]指出肺癌患者外周血中CD8+CD28+T細胞水平較健康對照組顯著減少，因此CD28表達水平下降可能系肺癌患者免疫功能降低的重要因素。

CD57(leu-7)是人類NK細胞的標志，當其特異性結合靶細胞上的配體后，可以激活NK細胞的細胞毒作用。CD57也部分表達于T淋巴細胞，通常為CTL的表面，其與CTL的效應功能有關[9]。CD57是一種糖蛋白，其分子量為110kD，CD57+T細胞主要存在于骨髓，其在外周血中數量很少，為5%～10%。在骨髓和其他器官移植術后、類風濕性關節炎及AIDS患者，CD57+T細胞水平均增高[10]，提示該細胞在導致免疫異常的疾病中發揮一定作用。也有文獻報道老年人CD8+CD57+T細胞明顯高于青年人[11]，表明其在免疫衰老中有著一定意義，而腫瘤常發生于老年患者，因而腫瘤患者中可能出現CD8+CD57+T細胞表達水平的相應升高。有相關報道顯示，CD57可以產生大量IFN-γ，且產生能力與數量相關[12]，而IFN-γ對腫瘤免疫發揮著重要作用。IFN-γ能夠直接抑制腫瘤細胞增殖，增加表面MHC抗原和腫瘤壞死因子表達，抗腫瘤血管生成等。由此可見，CD8+T細胞表面CD57增多可能體現肺癌患者免疫功能下降。

本研究結果表明：肺癌患者CD8+T細胞表面CD28表達水平顯著下降，而CD57較健康對照組明顯升高，兩組人群相比較CD28及CD57均差異有統計學意義(P<0.05)。通過兩療程化療后，緩解組病情逐漸好轉，與健康對照組比較差異無統計學意義，而未緩解組的患者CD28+T細胞和CD57+T細胞較健康對照組仍差異有統計學意義(P<0.05)。提示經化療好轉后，肺癌患者的免疫功能得到一定程度恢復，患者體內的腫瘤細胞數減少。本研究同時分析了臨床因素與CD28和CD57的相關性，結果表明CD8+CD28+T細胞及CD8+CD57+T細胞的表達在肺癌患者不同組織學類型方面差異無統計學意義(P>0.05)，而隨著臨床分期的增加，CD8+CD57+T細胞表達率也未發現明顯變化，究其原因，可能系本研究入組的為Ⅲ期和Ⅳ期中晚期肺癌患者，且多數為老年患者，臨床分期和年齡選擇不具代表性所致。而CD8+CD28+T細胞表達隨著臨床分期增加呈現逐漸升高，提示晚期肺癌患者免疫力降低，進一步表明CD28+T細胞增高水平可能與病情進展密切相關。研究結果表明該兩組指標可能為肺癌免疫功能下降的原因，檢測其表達可能評估肺癌患者療效及預后。