藍莓酵素中蛋白質和蛋白酶含量測定

鄭 斌 ，王 舒 ，王子迎 ，董華澤 ，謝 冬 ，王方闊 ，田 恒 ，陳 蕾 ，桂立新

（1.合肥師范學院化學與化學工程學院，安徽合肥 230061；2.金寨縣大別山林藝植物科技開發有限公司，安徽六安 237300）

酵素是一種由氨基酸組成的具有特殊生物活性的物質，它是一種存在于所有活的動植物體內的必需物質，有著維持正常機體功能、食物消化、組織修復等生命活動的功效。酵素又叫做“酶”，幾乎所有的生命活動都有它參與：問題的思考，運動，睡眠，呼吸，憤怒，哭泣或者荷爾蒙的分泌等都是以酵素為中心的活動結果[1]。如果沒有酵素的參與，將無法進行生化反應，而對機體來說五大營養素（碳水化合物、類脂質、蛋白質、維生素、礦物質）都將變的毫無用處，生命現象也將會停止。所以，酵素對生命來說至關重要，更有甚者很多人將它稱為“活著的物質”“掌握所有生命活動的物質”。酵素像催化劑一樣的催化作用催動著機體的生化反應，催動著生命現象的進行。生物體內的化學變化，幾乎都要在酵素的催化作用下進行，它帶動原本不會發生的化學反應，也可加速化學反應而不需改變本質。酵素的種類繁多，有些酵素會把蛋白質分解成較單純的化合物，其他的酵素則會再將這些化合物分解成更單純的物質，直到分解成氨基酸為止，最后變成水和二氧化碳。

藍莓，杜鵑花科植物，原生于北美洲和東亞地區，因含有的氨基酸，維生素，花青素，黃銅，有機硒，熊果甙和果酸等特殊營養成分是任何植物所無法比擬的，有著比一般植物更加優越的抗氧化活性，因而被譽為“世界水果之王”。藍莓具有解除眼部疲勞，延緩衰老，增強記憶力，促進心血管健康，預防癌癥等藥性功效，被國際糧農組織列為人類五大健康食品之一。長白山藍莓產地多集中在吉林省長白山地區的靖宇縣，撫松縣，長白山保護開發區等地，優越的自然資源賦予了長白山藍莓飽滿的漿果果實和獨特的鮮美味道，其經發酵后的藍莓酵素更是功效甚佳[2]。現市場上研究藍莓酵素的成熟理論主要是關于藍莓酵素在天然發酵過程中抗氧化能力的變化。是以還原力、羥基自由基清除能力、超氧自由基清除能力和DPPH自由基清除能力以及ABTS自由基清除能力為指標,多體系地考察發酵過程中抗氧化性能的變化,并進行相關性分析。最終結論表明，藍莓酵素在發酵過程中體現了高抗氧化性能，抗氧化性能基本呈現上升趨勢，與酚類物質含量相關性較大[3]。現如今市場上關于酵素的研究多關于微生物酵素和酵素粉，已成熟的多也是關于酵素的發酵過程中的抗氧化能力的變化。而藍莓酵素作為由果蔬發酵而成的酵素液關于其含量研究的并不多。而本論文對藍莓酵素的研究就是關于酵素中蛋白質和蛋白酶成分的測定，進行判定這批藍莓酵素中蛋白質和蛋白酶的含量標準。因此對于藍莓酵素的研究具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 蛋白質檢測方法原理

考馬斯亮藍法[4]測定蛋白質濃度，利用蛋白質-染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度，是一種快速、靈敏的方法。考馬斯亮藍G-250如圖1在不同的狀態下有著兩種不同的顏色形式，藍色和紅色。考馬斯亮藍G-250在酸性游離狀態下呈棕紅色，最大吸收光譜在465nm，當它與蛋白質結合后變為藍色，最大光吸收譜在595nm。在一定的蛋白質濃度范圍內，蛋白質-染料復合物在595nm波長處的OD值與蛋白質含量成正比，通過測定595nm處光吸收的增加量可知與其結合蛋白質的量。

圖1 G-250

蛋白質和考馬斯亮藍G-250結合，在大約2min的時候會達到平衡，反應的完成也十分迅速，其結合物也在室溫下1小時內保持穩定。蛋白質-染料復合物存在很高的消光系數，會讓在測定蛋白質濃度時靈敏度很高，能測微克級蛋白質含量[5]。

1.2 蛋白質檢測試劑

0.1 mg/ml標準蛋白質溶液（25mgBSA定容至250ml容量瓶中）

考馬斯亮蘭G-250染料試劑;95%的乙醇：47.5ml無水乙醇加2.5ml的水。

實驗器材：可見光分光光度計、旋渦混合器、試管16支，燒杯，玻璃棒，250mL容量瓶、1L容量瓶、分光光度計，移液管。

1.3 蛋白質檢測步驟過程

0～1mg/100ml標準曲線的制備：（用移液管取）取8支離心管，編號后，按表1加入試劑，蓋塞后，將各試管中的溶液縱向倒轉混勻，室溫靜止10min后，以管一為空白對照，在595nm下比色測定。以標準維生素C含量（mg）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪出標準曲線。

表1 不同含量的標準蛋白質溶液在595nm處吸光度

將標準1號設為空白校正，用標準6號測最大吸收峰，最大吸收峰的波長為594nm，先測標準溶液的吸光度，繪制標準曲線。再將1～6號酵素原液均量取0.1mL加0.9ml去離子水稀釋到試管中。用移液槍取。均再加5ml考馬斯亮藍，搖勻。利用分光光度計依次測其吸光度，由樣品液的吸光度查標準曲線即可求出含量（表2）。

表2 不同組樣品在595nm處吸光度

計算：通過蛋白質標準溶液的光譜圖得在594nm處有最大吸收峰，在595nm處測得不同含量的蛋白質標準溶液的光密度，得出標準曲線。之后對樣品進行紫外光譜測定，對比標準曲線圖得到樣品中的蛋白質含量。

1.4 蛋白酶檢測方法原理

福林法[6]：通過10ug/ml酪氨酸溶液和蒸餾水配制各種不同濃度的酪氨酸溶液，然后通過紫外分光光度計長出溶液的最大吸收波長，之后通過最大吸收波長求出在最大吸收波長處的吸光度，并給出標準曲線。再通過樣品對2%蛋白酶的分解量進行紫外分光光度計分析并與給出的標準曲線進行比對，得出樣品中蛋白酶的含量。

1.5 蛋白酶檢測試劑及器材

福林試劑：福林酚以加入一倍蒸餾水的量進行使用。

0.4 mol三氯乙酸（TCA）溶液，0.4mol碳酸鈉溶液，pH7.2磷酸鹽緩沖液，2%酪蛋白溶液，100ug/ml酪氨酸溶液。

分析天平，光電比色計或分光光度計，水浴鍋，移液管。

1.6 蛋白酶檢測步驟與過程

各種不同濃度的酪氨酸溶液配制見表3：

表3 不同濃度酪氨酸配制

表4 不同濃度酪氨酸的光密度測定

樣品的平均光密度（OD）-空白的平均光密度（OD）=凈OD值[7]。

取6只試管并編號，按照表3各吸取不同濃度酪氨酸1ml，各加入0.4mol碳酸鈉5ml，再分別加入已稀釋的福利試劑1ml。搖勻后放置于水浴鍋中。在40℃溫度下保溫發色20min，然后在紫外分光光度計上分別測定光密度（OD值），減去1號管（蒸餾水空白試驗）所測得的OD值為凈OD值。并列表4列參數：試劑，按表3制備的不同濃度酪氨酸，ml（均為 1），0.4mol/l碳酸鈉，5ml，OD 值（1，2，3平均），凈 OD值。樣品稀釋液的制備：取樣品發酵液1ml加入9ml蒸餾水。樣品測定：取 15×100mm 試管 3 支，編號 1、2、3、（2 只也可），將樣品稀釋液向每管內加入1ml，置于40℃水浴鍋中水浴預熱2min，再分別加入酪蛋白1ml并經同樣預熱，精確保溫10min，一到時間，立即再分別加入0.4mol三氯乙酸2ml，以結束反應，繼續放于水浴鍋中水浴保溫20min。離心或過濾沉淀后的殘余蛋白質，再重新取15×150mm試管三支，編號1、2、3，分別加入濾液1ml，再加0.4ml碳酸鈉5ml以及稀釋后的福林試劑1ml，并搖勻。40℃水浴鍋水浴保溫發色20min后測定光密度（OD值）。空白試驗液取3支試管，編號，測定方法和上述一樣，只是在加入酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2ml，讓酶失去活性，再加入蛋白酶。基于方便起見，分別列出表5樣品和空白實驗準備和表6樣品和空白實驗的光密度測定。

表5 樣品和空白實驗準備

表6 樣品和空白實驗的光密度測定

計算：在 40℃下每分鐘水解酪蛋白產生lug酪氨酸，定義為1個蛋白酶活力單位[8]。

樣品蛋白酶活力單位（干基）=A/10×4×N×1/（1-W）

式中：A-樣品所測OD值，根據標準曲線得相當的酪氨酸微克數（或OD值× K）；

4——4毫升反應液取出1mL測定（即4倍）；

N——酶液稀釋的倍數；

10——反應10min；

W——樣品水分百分含量[9]。

2 結果分析

2.1 蛋白質檢測結果

實驗結果可得蛋白質標準溶液在最大吸收光譜處的光密

表7 蛋白質標準溶液在最大吸收光譜處的光密度

表8 樣品溶液在最大吸收光譜處的光密度

兩組數據的平均值分別為：25.5238mg/ml；27.0640mg/ml

兩組數據的標準差分別為：7.2171；6.1382度如表7。

由表7得回歸方程為，C=-26.3899×A+38.1927

其中為單波長法，λ=594 nm 單位（mg/ml）

測得樣品溶液在最大吸收光譜處的光密度如表8并通過回歸方程求得含量。

圖2 定量分析報告

2.2 蛋白酶檢測結果分析

樣品溶液通過紫外分光光度計測得在最大吸收峰740nm處的吸光度如下圖2中所示，通過配制的已知濃度的不同酪氨酸溶液在740nm的吸光度得出標準曲線也如下圖。然后通過紫外分光光度計對樣品溶液在740nm處的測定，得出吸光度，對比標準曲線得到樣品溶液中所含蛋白酶的含量濃度。所測結果相似性是因為這是同一批次在同一實驗條件的實驗測定，所以對比實驗中吸光度雖有小的差異，但根據標準曲線的取得原則擇優之后標準曲線并無變化，即多組實驗所得標準曲線并無太大區別，所得最后結果也幾近相同，故而分析這一批次的某一組數據進行代表表征。并且通過下圖2分析可得這組數據的平均值為23.939ug/ml；標準差為：2.4202。

3 結論

藍莓酵素中含有豐富的蛋白質和蛋白酶，從而使酵素有著良好的分解作用和促進新陳代謝作用以及凈化血液的作用。通過對樣品-發酵液的稀釋液中蛋白質和蛋白酶含量的測定，經過實驗，得到數據處理分析后得出了這一批次中兩組藍莓發酵液的蛋白質含量平均值分別為25.5238mg/ml；27.0640mg/ml；兩組數據的標準差分別為7.2171、6.1382。這組藍莓發酵液的蛋白酶含量平均值為23.939ug/ml；標準差為2.4202。此項研究為大家提供一種可以借鑒的道路，以后可按照這種方法對藍莓酵素中蛋白質和蛋白酶含量進行測定。