Lnc-ATB通過吸附miR-433促進宮頸癌侵襲及轉移

李柏森 文敏 易紅梅 姜鶴群

1電子科技大學醫學院附屬腫瘤醫院，四川省癌癥防治中心，四川省腫瘤醫院放療中心（成都 610041）；成都醫學院第一附屬醫院 2胸心外科，3腫瘤科（成都 610500）

宮頸癌為女性發病率第二高的惡性腫瘤，其病原體主要為高風險性的人乳頭瘤病毒（high-risk human papillomavirus，HPV）［1-2]。隨著早期篩查的普及和治療手段的豐富，宮頸癌患者的診斷和預后均得到了顯著的提升。然而，宮頸癌發病機制仍不完全清楚，明確其發病機制，鑒定新的潛在治療靶點具有重要意義。轉化生長因子β（transforming growth factorβ）活化長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA）LncRNA-ATB（Lnc-ATB）是首個被發現可被轉化生長因子活化的長鏈非編碼RNA［3]，研究發現Lnc-ATB在腎癌［4]、乳腺癌［5]和結腸癌［6]等腫瘤中異常高表達，并可通過吸附miR-200家族成員而促進腫瘤的侵襲和轉移。然而，尚缺少關注Lnc-ATB在宮頸癌中細胞中的表達和作用的相關機制研究。本課題擬檢測Lnc-ATB在宮頸癌細胞系中的表達，并明確Lnc-ATB在宮頸癌侵襲和轉移中的作用及潛在機制。本研究結果首次證實了Lnc-ATB在宮頸癌細胞中高表達，并通過吸附結合miR-433促進宮頸癌細胞侵襲轉移，為宮頸癌提供了新的分子靶點。

1 材料與方法

1.1 材料Trizol購買于美國Sigma公司；RNA反轉錄及QPCR試劑盒購買于日本TAKARA公司；Transwell小室購買于美國Millipore公司；細胞侵襲鋪板用基質膠購買于美國BD公司；螢光素酶報告基因檢測試劑盒購買于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉錄細胞培養過夜至匯合度80%，加入Trizol裂解。離心5 min，上清加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。離心15 min，加入等體積異丙醇，上下顛倒15次，靜置10 min。離心15 min。棄去上清，加入75%的乙醇1 mL，離心5 min。所得沉淀加入20μL去離子水，即為所需RNA。

1.2.2 反轉錄采用10μL體系，RNA定量后，取1μL RNA，加入5x PrimeScript RT master 2μL，7 μL去離子水。輕柔混勻后，進行反轉錄反應。反應條件為：37℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃儲存。

1.2.3 實時定量PCR反應配置PCR反應液，PCR反應采用25μL體系，組分如下：SYBR premix Ex TaqⅡ 12.5μL，正義鏈引物1μL，反義鏈引物1μL，實時定量產物2μL，去離子水8.5μL。PCR反應條件為：預變性95℃ 30 s；擴增95℃ 15 s，60℃30 s，共30個循環。反應結束后樣品保存于4℃。

1.2.4 Transwell細胞侵襲實驗采用的小室為預先鋪好基質膠的Transwell小室，其余步驟同細胞轉移實驗。細胞轉移能力檢測試驗步驟如下，將無菌Tranwell小室置于24孔板中，24孔板加入700μL的含15%胎牛血清的1640培養基，Transwell小室中加入200μL總數為1×105個細胞的細胞懸液，將24孔板置于細胞孵箱中培養36 h。而后，棄去Transwell小室中的液體，取出小室，濕棉簽輕拭去未穿過膜的細胞。甲醇固定10 s，結晶紫染色30 s，PBS洗滌，完整切除小室膜，封片。顯微鏡200倍視野下統計隨機十個視野的細胞術，拍照，繪制統計圖。

1.2.5 細胞劃痕接種宮頸癌細胞接種室6孔板中，孵育至宮頸癌細胞融合率達到100%后，用1 mL槍頭均勻地在6孔板細胞接種孔中間部位劃痕，劃痕后用PBS清洗細胞3次，而后加入不含血清的培養基。倒置顯微鏡拍照，將細胞間間隙定義為0 h。于細胞培養箱中培養24 h后，再次拍照，此時細胞間間隙定義為24 h。兩次拍照間單側的間隙距離之差，即為細胞的遷移距離。

1.2.6 熒光素酶報告基因實驗細胞培養過夜至匯合度達70%后，共轉染miR-433 mimics/miR-433 NC和pmiR-GLO-WT/Mut Lnc-ATB質粒。裂解細胞后，取10μL樣品加入100μL熒光素酶檢測試劑，上機測定熒光值。

1.3 統計學方法數據分析均采用SPSS 22.0統計軟件，計量資料以均數±標準差表示，3組數據間的比較依次采用方差分析和兩兩比較的t檢驗；兩組數據間的比較直接應用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Lnc-ATB在宮頸癌細胞及正常宮頸內皮細胞中的表達差異QPCR結果顯示：Lnc-ATB在正常宮頸內皮細胞（normal cervical endothelial cells，NCEC）中的相對表達量為1.000±0.050，Lnc-ATB在宮頸癌HeLa細胞中的相對表達量為4.132±0.147，在宮頸癌SiHa細胞中的相對表達量為3.717±0.064。方差分析結果顯示，3組間差異有統計學意義（F=21.436，P＜0.05）。進一步應用t檢驗分析Lnc-ATB在HeLa與NCEC，及SiHa與NCEC之間的表達水平差異，結果顯示，LncATB在HeLa與NCEC及SiHa與NCEC之間的表達水平差異有統計學意義（圖1A：HeLavs.NCEC：t=5.921，P=0.027；SiHavs.NCEC：t=4.817，P=0.033），HeLa及SiHa細胞中Lnc-ATB的表達水平顯著高于NCEC細胞。

為了研究Lnc-ATB對宮頸癌細胞侵襲及轉移的影響，本研究合成了特異性沉默Lnc-ATB表達的慢病毒shRNA，QRT-PCR結果顯示：感染Lnc-ATB NC的宮頸癌HeLa細胞中LncRNA-ATB的相對表達量為1.000±0.050，感染Lnc-ATB shRNA慢病毒的宮頸癌HeLa細胞中LncRNA-ATB的相對表達量為0.315±0.017，t檢驗結果顯示兩組間Lnc-ATB表達差異有統計學意義（圖1B：t=4.889，P=0.031）。感染Lnc-ATB NC的宮頸癌SiHa細胞中LncRNA-ATB的相對表達量為1.000±0.050，感染Lnc-ATB shRNA慢病毒的SiHa細胞中LncRNAATB的相對表達量為0.373±0.023，t檢驗結果顯示兩組間Lnc-ATB表達差異有統計學意義（圖1B：t=4.172，P=0.037）。Lnc-ATBshRNA可特異性地沉默HeLa及SiHa細胞中Lnc-ATB的表達。

2.2 Lnc-ATB促進宮頸癌細胞轉移能力Tranwell實驗結果顯示，感染Lnc-ATBNC的宮頸癌HeLa細胞及SiHa細胞的相對轉移細胞比為1.000±0.050，感染Lnc-ATB shRNA慢病毒的宮頸癌HeLa細胞及SiHa細胞的相對轉移細胞比分別為0.327±0.013和0.414±0.015。t檢驗結果顯示兩組間轉移細胞比率差異有統計學意義（圖2）。沉默Lnc-ATB可抑制宮頸癌細胞轉移能力。

圖1 LncRNA-ATB在正常宮頸內皮細胞及宮頸癌細胞系中的表達水平Fig.1 Expression of LncRNA-ATBin NCECand cervical cancer

圖2 Lnc-ATB促進宮頸癌細胞轉移（×200）Fig.2 Lnc-ATBpromote cell migration of cervical cancer（×200）

2.3 Lnc-ATB促進宮頸癌細胞遷移能力細胞劃痕實驗結果顯示，轉染Lnc-ATBNC的HeLa細胞及SiHa細胞的相對遷移距離為1.000±0.050，轉染Lnc-ATB shRNA的HeLa細胞及SiHa細胞的相對遷移距離為0.518±0.062和0.477±0.059。t檢驗結果顯示兩組間細胞遷移距離差異有統計學意義（圖3：HeLa：t=3.451，P=0.041；SiHa：t=3.551，P=0.037）。沉默Lnc-ATB表達的宮頸癌細胞遷移距離短于Lnc-ATB NC組。

圖3 Lnc-ATB促進宮頸癌細胞轉移距離（×100）Fig.3 Lnc-ATBpromote migrated distance of cervical cancer（×100）

2.4 Lnc-ATB促進宮頸癌細胞侵襲能力Transwell實驗結果顯示：轉染Lnc-ATB NC的HeLa細胞及SiHa細胞的相對侵襲細胞比率為1.000±0.050，轉染Lnc-ATB shRNA的HeLa細胞及SiHa細胞的相對侵襲細胞比率為0.416±0.033和0.515±0.032。t檢驗結果顯示兩組間轉移細胞比率差異有統計學意義（圖4：HeLa：t=3.225，P=0.039；SiHa：t=2.882，P=0.042）。沉默Lnc-ATB可抑制宮頸癌細胞侵襲能力。

圖4 Lnc-ATB促進宮頸癌細胞侵襲（×200）Fig.4 Lnc-ATB promote cell invasion of cervical cancer（× 200）

2.5 Lnc-ATB在HEK-293T細胞中可吸附miR-433如圖5A，生物信息學預測結果顯示Lnc-ATB存在miR-433結合位點，熒光素酶報告基因結果顯示，轉染miR-433 NC和pmirGLO-ATB WT組相對熒光強度為1.000±0.050，轉染miR-433 mimics和pmirGLO-ATBWT組相對熒光強度為0.312±0.041，經t檢驗，兩組差異有統計學意義（圖5B，t=4.184，P=0.022），miR-433可特異性地與Lnc-ATB結合并降低其熒光強敵。

2.6 Lnc-ATB在宮頸癌細胞中下調miR-433的表達QPCR結果顯示轉染miR-433 NC的HeLa及SiHa細胞中Lnc-ATB的相對表達水平為1.000±0.050，轉染miR-433 mimics的HeLa細胞及SiHa細胞中Lnc-ATB的相對表達水平分別為0.953±0.048和0.097 4±0.061，t檢驗結果顯示，兩組間Lnc-ATB表達差異無統計學意義（圖6A：HeLa：t=0.515，P=0.368；SiHa：t=0.412，P=0.419）。轉染Lnc-ATB NC組HeLa細胞及SiHa細胞中miR-433的相對表達水平為1.000±0.050，轉染Lnc-ATB shRNA組的HeLa細胞及SiHa細胞中miR-433的相對表達水平為3.318±0.105和2.938±0.074。t檢驗結果顯示，兩組間miR-433差異有統計學意義（圖6B：HeLa：t=4.981，P=0.018；SiHa：t=3.217，P=0.021）。沉默宮頸癌細胞中Lnc-ATB的表達可使miR-433表達水平上調。

圖5 Lnc-ATB在宮頸癌中吸附結合miR-433Fig.5 Lnc-ATBsponge and bind with miR-433 in cervical cancer

圖6 Lnc-ATB在宮頸癌細胞中下調miR-433的表達Fig.6 Lnc-ATBdown-regulated miR-433 expression in cervical cancer

3 討論

既往研究顯示，多種腫瘤和疾病中均存在Lnc-ATB的異常表達，在肝細胞癌［7]、甲狀腺乳頭狀癌［8]、腎細胞癌［4]、骨肉瘤［9]等多種腫瘤中Lnc-ATB表達異常上調，是潛在的致癌分子。在宮頸癌細胞和組織中，研究顯示Lnc-ATB表達亦異常上調，并與腫瘤體積、淋巴結轉移情況和FIGO分期密切相關。更為重要的是，Lnc-ATB與宮頸癌患者術后不良預后密切相關，可作為判斷宮頸癌患者預后的獨立預測指標［10]。與既往研究結果相符，本研究結果顯示Lnc-ATB在宮頸癌HeLa細胞和SiHa細胞中的表達水平高于正常宮頸內皮細胞，進一步提示Lnc-ATB在宮頸癌發生及進展中發揮著致癌分子的作用。

Lnc-ATB是可特異性被TGF-β通路活化的長鏈非編碼RNA。其可通過吸附miR-200家族成員而間接上調ZEB1、ZEB2等miR-200家族的靶分子，并可抑制上皮間質轉化過程中的重要分子E-cadherin的表達，從而促進腫瘤的侵襲和轉移能力［2，10]。本研究結果顯示，沉默宮頸癌細胞中Lnc-ATB的表達后，宮頸癌細胞侵襲和遷移細胞數目減少，細胞遷移距離縮短，提示沉默Lnc-ATB的表達，可抑制宮頸癌的侵襲能力。

本研究利用生物信息學手段尋找與Lnc-ATB存在潛在結合位點的miRNA。結果顯示miR-433存在Lnc-ATB結合位點，并可與其結合。進一步研究表明Lnc-ATB可在宮頸癌細胞中特異性地下調miR-433的表達。MiR-433是經典的腫瘤抑制性miRNA，在口腔鱗狀上皮癌中，miR-433可通過靶向抑制FAK的表達而抑制其細胞增殖［12]。在宮頸癌中，miR-433表達異常下調，并與宮頸癌瘤體大小、FIGO分期、淋巴結轉移情況和遠處轉移情況呈負相關，其潛在機制為miR-433通過直接抑制異粘蛋白的表達而調控AKT和β-catenin信號通路，從而抑制宮頸癌細胞的發生及進展［13]。結合既往研究結果和本研結果，提示Lnc-ATB在宮頸癌細胞中發揮競爭性內源性RNA作用，吸附并降低miR-433的表達，使其抑癌作用受到抑制，從而促進宮頸癌的侵襲和轉移，需進一步的機制研究明確Lnc-ATB與miR-433之間的調控關系。

綜上所述，本研究通過QCR技術檢測了宮頸癌和正常宮頸細胞中Lnc-ATB的表達差異，發現Lnc-ATB在宮頸癌細胞中的表達顯著高于正常宮頸細胞。沉默宮頸癌細胞中Lnc-ATB的表達后，宮頸癌細胞的侵襲和轉移能力降低。機制研究結果顯示，Lnc-ATB在宮頸癌細胞中可吸附并下調miR-433的表達。本研究結果進一步明確了宮頸癌侵襲和轉移的分子機制，提供了潛在的宮頸癌靶向治療靶點。