線粒體轉錄因子A與冠心病的相關性

嚴亞琪 李碩 董文超 劉超 王鵬飛 侯維娜 侯瑞田 丁振江 王瑞鵑

承德醫學院附屬醫院心臟內科（河北承德 067000）

冠心病（coronary heart disease，CHD）一直被認為是世界范圍內的主要死亡原因，在過去的幾十年中，有效的診斷方法能減少其對全球公共衛生的負擔［1]。但在中國這樣的發展中國家仍有上升的趨勢。冠心病的病理基礎多為冠狀動脈粥樣硬化。mtDNA的損傷可以導致線粒體功能障礙，促進炎癥及細胞凋亡，這些皆可推動動脈粥樣硬化的進程；因此mtDNA的損傷可能與動脈粥樣硬化有關［2-3]。外周血線粒體轉錄因子A（mitochondrial transcription factor A，TFAM）通過包裹mtDNA形成類似組蛋白的核樣結構［4]，維護其完整和穩定，使其免受氧化應激（ROS）損傷［5]；同時通過促進mtDNA的復制來調節其拷貝數，這是TFAM保護線粒體功能的基礎［6]。KRISH等［7]證明了過表達的TFAM可防止糖尿病DRG神經元中的mtDNA拷貝數的減少，并預防實驗性的糖尿病神經病變，從而保護DRG神經元免受氧化應激的損傷。因此TFAM可作為研究線粒體生物合成調控機制的重要靶點之一。有研究表明冠心病患者中外周血mtDNA拷貝數較正常人明顯減少，這種變化可作為氧化應激水平增加的指標，同時可用來評估冠心病的嚴重程度［8]。在對線粒體的調控中，相較于mtDNA來說TFAM的變化更早期、更直接，目前，尚未見冠心病與TFAM的相關報道，為此，本研究對冠心病患者外周血的TFAM mRNA進行了檢測來證明TFAM的表達是否與冠心病密切相關。

1 對象與方法

1.1 研究對象選取2017年3-9月在承德醫學院附屬醫院住院擬診為冠心病無親屬關系，且無其他類型冠狀動脈病變、心臟傳導系統正常的患者，根據納入及排除標準，共納入92例患者，其中冠脈造影確診為CHD（至少1支主要血管狹窄程度≥50%）患者56例為CHD組（男36例，女20例），36例冠狀動脈造影陰性者為對照組（男19例，女17例）。

1.2 排除標準所有受試者均排除縮窄性心包炎、心臟瓣膜病、心力衰竭、心源性休克、嚴重肝腎功能不全、發熱及感染、線粒體相關性疾病、近期重大手術外傷、各種惡性腫瘤、結締組織病等。本研究獲得我院倫理委員會批準，所有入選患者在研究前均簽署知情同意書。

1.3 流行病學與臨床資料收集記錄研究對象的一般資料和既往病史，包括性別、年齡、吸煙史、飲酒史、既往高血壓及糖尿病病史。測量入院時身高、體重、血壓（收縮壓SBP、舒張壓DBP），計算體質量指數（BMI）。臨床指標測定：測定總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、靜脈空腹血糖（FBG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cre）、尿酸（UA）、白細胞、中性粒細胞計數（neutrophil）、淋巴細胞計數（lymphocyte）及紅細胞分布寬度（red cell distribution width，RDW），并計算中性粒細胞計數與淋巴細胞計數比值（neutrophil to lymphocyte ratio，NLR）。

1.4 實時定量PCR法檢測TFAM mRNA水平所有研究對象均采集肘靜脈血至少3 mL，以肝素鈉抗凝，樣品收集完成后，應用Qiagen血液基因組RNA提取試劑盒（QIAamp RNA Blood Mini Kit），嚴格按試劑盒說明書進行操作提取2組血液樣品中的RNA，應用FastQuant cDNA第一鏈合成試劑盒（FastQuant RT Kit）對所提取的RNA進行反轉錄；并應用Combasz 480實時PCR定量檢測儀擴增TFAM和管家基因（GAPDH），獲得TFAM的特異性擴增曲線和溶解曲線。引物序列為TFAM上游引物：5′-GCATCTGGGTTCTGAGCTTT-3′，下游引物：5′-CCGAGGTGGTTTTCATCTGT-3′；GAPDH 上游引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。反應體系（25μL）：ddH2O 9.0 μL，2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，PCR正向引物（55μmol/L）0.75μL，PCR反向引物（55μmol/L）0.75μL，待測cDNA模板（200 ng/μL）2μL。反應條件：95℃預變性10 min；95℃變性10 s，62℃退火20 s和72℃延伸20 s，共45個循環。實驗數據應用目的基因Ct值與管家基因Ct值的比值作為每個標本TFAMmRNA的表達水平，其中Ct值為標本擴增到規定閾值時PCR循環數，Ct比值越大表示表達量越低。

1.5 冠狀動脈血管病變支數及狹窄程度評價所有患者均以Judkins法行冠狀動脈造影術，由兩位心內科介入組醫生進行診斷，若診斷結果出現不統一的情況下，另請一位介入醫生進行診斷，全程采用盲法分析。記錄冠狀動脈有無狹窄等。將冠狀動脈管腔狹窄≥50%納入CHD組。

1.6 統計學方法采用統計軟件SPSS19.0處理數據。計量資料正態性檢驗選Kolmogorov-Smirnova檢驗，符合正態分布，用均數±標準差表示，2組間均數比較選擇t檢驗；計數資料用頻數（百分比）表示，組間率或構成比的比較用χ2檢驗。采用Pearson相關分析以明確指標之間的相關性，TFAM mRNA與冠心病的相關性采用Spearman相關分析。冠心病的危險因素分析采用多因素Logistic回歸分析，在單因素分析的基礎上，選取有意義的（包括年齡、NLR、吸煙及TFAM mRNA的Ct比值）納入多因素Logistic回歸方程。上述均為雙側檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

士人贊賞的態度固然激發了女性詩人更多的創作熱情，對于士人反對的聲音，女性詩人的心態與回應也不盡相同。部分女詩人自覺約束自己的行為，毀棄詩作，放棄寫作，以合乎“規范”；另有一部分女詩人依然堅持寫作，她們或私下進行，或公然反抗。

2 結果

2.1 兩組臨床資料、血液檢測指標及外周血TFAM mRNA含量比較結果顯示兩組在性別、年齡、SBP、DBP、BMI、吸煙率、飲酒率、高血壓患病率、糖尿病患病率方面差異無統計學意義（P＞0.05）；在冠心病組患者中，TFAM mRNA的Ct比值（1.39±0.06）高于對照組（1.35±0.08），即TFAM mRNA表達量低于對照組；NLR值（3.37±2.31）高于對照組（2.46±1.32）；淋巴細胞計數（24.77±8.40）低于對照組（29.04±7.47）；差異均有統計學意義（P＜0.05）。見表1、2。

表1 兩組患者基線資料的比較Tab.1 Comparison of the baseline datas between CHD group and control group

表2 兩組患者血液檢測指標的比較Tab.2 Comparison of the blood index between CHD group and control group ±s

表2 兩組患者血液檢測指標的比較Tab.2 Comparison of the blood index between CHD group and control group ±s

注：WBC，白細胞計數；Neu，中性粒細胞計數；Lym，淋巴細胞計數；RDW，紅細胞分布寬度；TC，總膽固醇；TG，甘油三酯；HDL-C，高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C，低密度脂蛋白膽固醇；FBG，靜脈空腹血糖；BUN，尿素氮；Cre，肌酐；UA，尿酸；NRL，中性粒細胞計數與淋巴細胞計數比值；TFAM mRNA的Ct比值，目的基因Ct值與管家基因Ct值的比值

指標WBC（109/L）Neu（109/L）Lym（109/L）RDW（%）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）FBG（mmol/L）Cre（mmol/L）BUN（umol/L）UA（mmol/L）TFAMmRNA的Ct比值NLR對照組（n=36）6.61±1.50 62.83±9.28 29.04±7.47 42.26±2.78 4.25±1.09 1.95±1.23 1.16±0.27 2.28±0.76 6.29±2.37 64.33±14.24 5.63±1.55 324.07±93.18 1.35±0.08 2.46±1.32 CHD組（n=56）7.13±2.11 66.64±9.78 24.77±8.40 42.35±2.45 4.10±1.40 1.98±1.43 1.10±0.32 2.13±0.91 6.69±2.41 67.53±13.72 5.49±1.44 320.53±79.48 1.39±0.06 3.37±2.31 t值-1.302-1.880 2.483-0.163 0.539-0.105 0.957 0.835-0.782-1.069 0.451 0.195-2.664-2.139 P值0.196 0.064 0.015 0.871 0.591 0.917 0.341 0.406 0.436 0.289 0.653 0.846 0.009 0.035

2.2 相關性分析Pearson相關分析：TFAMmRNA的Ct比值與中性粒細胞計數、NLR呈正相關，分別為r=0.316、P=0.002，r=0.238、P=0.023；與淋巴細胞計數呈負相關，r=-0.323、P=0.002；則TFAM mRNA與中性粒細胞計數、NLR呈負相關，與淋巴細胞計數呈正相關。Spearman相關分析：TFAM mRNA的Ct比值與冠心病呈正相關，r=0.227、P=0.029，則TFAM mRNA與冠心病呈負相關。

2.3 多因素Logistic回歸結果年齡（OR=1.058，95%CI：1.003 ～ 1.115，P=0.038）及 TFAM mRNA的 Ct比值（OR=2.358，95%CI：1.166 ～ 4.765，P=0.017）可能是冠心病的危險因素，而TFAM mRNA可能是冠心病的保護因素。見表3。

3 討論

TFAM是由核基因編碼的一種小分子多肽，能激活及調節線粒體轉錄及復制，并在氧化應激中起著重要作用。研究表明，在缺血再灌注心肌細胞中，TFAM水平明顯下降，并且在已死亡心肌中TFAM表達消耗殆盡［9-10]。同時近期研究顯示，可以通過檢測外周血TFAM mRNA水平來預測關節疾病，且外周血TFAMmRNA的表達量與軟骨細胞TFAM的表達量呈正相關（r=0.662，P＜ 0.01）［11]。因此本研究通過實時熒光定量PCR技術測定了56例CHD患者和36例對照組患者外周血TFAM mRNA的水平，發現CHD組與對照組相比，外周血TFAM mRNA表達量低，差異具有統計學意義。

表3 冠心病的多因素Logistic回歸分析Tab.3 Multivariate logistic regression analysis of CHD

在冠狀動脈粥樣硬化的發生發展過程中，內皮細胞功能障礙發揮著重要的作用［12]。近年來許多實驗證明內皮細胞線粒體損傷和功能障礙可由氧化應激誘導［13-14]。氧化應激通過ROS的產生及脂質過氧化對動脈粥樣硬化產生影響，從而引起血管的炎癥反應。

線粒體作為細胞內ROS的主要靶點，ROS產生的增加誘導了mtDNA的顯著損害［8]。研究表明線粒體DNA在線粒體能量代謝中起重要作用，因此線粒體DNA的改變（線粒體DNA的突變或者拷貝數的變化）都可能會導致氧化磷酸化障礙，增加ROS的產生或使線粒體生物合成減少。同時，上述改變反過來又會加速線粒體DNA的異常［15]。這種惡性循環最終會誘導線粒體功能障礙，從而導致細胞的凋亡［16]，這在動脈粥樣硬化早期階段具有重要意義［14]。既往進行了相關研究，發現了冠心病患者靜脈血中mtDNA的變化趨勢，而這種變化可能與TFAM存在一定的相關性。

TFAM作為線粒體生物合成的主要因子，具有誘導特定區域線粒體DNA結構改變的功能。目前研究顯示，TFAM可調控DNA的轉錄、復制、重組及空間結構及線粒體ATP的產生［5]。另外多項研究表明，在氧化應激作用下，TFAM作為保護因子可以對抗ROS對細胞線粒體的損傷［9，17-18]，本研究Spearman相關性分析顯示TFAM mRNA與冠心病呈負相關；多因素Logistic回歸分析示TFAM mRNA為冠心病的保護性因素。因此，TFAM表達量的改變對mtDNA含量及線粒體功能具有重要的作用，這與既往所做的研究結論是一致的［19]，并且本研究顯示與冠心病組相比，對照組中TFAM mRNA的表達量更高，由此，本研究推測外周血TFAM mRNA表達量與冠心病密切相關。

本研究是回顧性觀察性研究，缺少干預。且選取病例數偏少，使得檢驗效能下降。本研究的患者均選自承德醫學院附屬醫院心臟內科住院患者，未采用隨機對照，存在選擇偏倚。另外目前外周血TFAM mRNA沒有確定的正常范圍。

綜上所述，冠心病與TFAM密切相關，但其與冠脈病變嚴重程度及冠心病的預后是否相關還需日后進行更深一步的研究。