宮頸癌中DNMT1的高表達與其不良生存結局的相關性

羅舒 陳非 郭黔 文慶蓮

西南醫科大學附屬醫院腫瘤科（四川瀘州 646000）

宮頸癌是目前女性最常見的惡性腫瘤之一，近三十年，中國宮頸癌發病率提高了10%～40%［1]。據世界衛生組織（WHO）數據估算，每年全世界的新發病例有528 000例，死亡約26 000例［2]。輔助放療（放化療）加用鉑類化療可提高單純放療后晚期宮頸癌患者的生存率，但5年相對生存率仍較低［3]。由于宮頸癌影響年輕女性，尤其是在發展中國家，女性失去生命不僅影響女性，而且影響整個家庭的福祉。要改變這樣的現狀就需要進行新穎的及量身定制的治療方法來改變這種疾病的預后。

人乳頭瘤病毒的癌蛋白E6/E7可結合和上調DNMTs，使得基于DNA甲基化的新型治療對于宮頸癌尤為重要。盡管宮頸癌中DNMTs高表達，且與DNMT1相關的DNA甲基化在腫瘤進展中起關鍵作用［4-5]，但是，目前確沒有研究評估DNMTs的表達與宮頸癌生存的相關性。評估DNMT1的表達程度及其與宮頸癌生存的關聯是重要的，這可能提供DNMT抑制劑治療宮頸癌的機會。研究表明DNMT抑制劑能夠通過內源性逆轉錄病毒和癌睪丸抗原的去甲基化來上調上皮癌細胞中的免疫信號。此外，有眾多臨床研究在測試結合表觀遺傳療法和免疫療法治療某些癌癥的療效，但目前并沒有針對宮頸癌的測試［6]。基于此，本研究將從表觀遺傳學入手，探討宮頸癌中DNMT1的高表達與其不良的生存結局的相關性，以期為宮頸癌的治療提供新的方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2012～2016年在西南醫科大學附屬醫院腫瘤科就診的102例患者，年齡35～72歲，平均（46.18±11.10）歲。其中鱗癌75例，癌旁組織20例作為對照，腺癌30例，癌旁組織10例作為對照，同時各選取同時期因子宮肌瘤切除子宮的正常宮頸組織20例作為對照，所有新鮮組織由手術或活檢獲取，所有患者術前均未接受放化療。為了滿足患者數據的機密性，研究中使用的所有標本都被剝離了標識符，整個研究中只使用了編碼標識符。

1.2 試劑及方法

1.2.1 DNMT1免疫組化檢測將層厚約4μm的石蠟組織切片，二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，以pH 9.0的EDTA溶液進行抗原修復，抗原恢復后，將切片冷卻，在去離子水（dH2O）中漂洗，并在室溫下置于3.5 mol/L HCl中15 min以打開DNA，將切片用dH2O沖洗并用3.0%H2O2處理5 min以淬滅內源性過氧化物酶活性，將切片與預免疫山羊血清（3%）在室溫下孵育20 min以抑制非特異性染色，然后在室溫下用DNMT1抗體（1∶100濃度）孵育1 h。用Tris緩沖鹽水充分洗滌后，使用多特異性體系（Signet Laboratories，Inc.，Dedham，MA，USA）檢測一抗。根據制造商的說明書（Biogenex，Inc.，San Ramon，CA，USA），使用3，3-二氨基聯苯胺底物試劑盒使抗體-抗原復合物可視化，并用蘇木精輕度復染色。將切片依次浸入70%，95%和100%乙醇中（每次3 min），然后使其略微干燥。最后，將載玻片浸在二甲苯中3次（每次3 min），之后用蓋玻片保護。

1.2.2 免疫染色評估基于對細胞核中棕色反應產物的強度的視覺評估，以兩個觀察者獨立地記錄DNMT1在細胞核中的表達程度，0（無染色）至4+（強染色）。DNMT1的表達程度是陽性的細胞的總百分比乘以適當的強度得分。除宮頸癌外，DNMT1陽性細胞百分率取正常上皮基底，下半部和上半部分的強度評分的平均值，以獲得DNMT1平均表達程度。無論宮頸癌組織或正常組織報告的DNMT1表達程度均取兩個觀察者的平均值。

1.3 統計學方法應用Graphpad 6.01軟件中survival table對DNMT1表達與生存率的關系進行統計分析。通過Kaplan-Meier方法估計存活曲線，并使用Cox的比例風險回歸模型進行多變量分析。DNMT1陽性細胞百分比及表達強度的相關性以Spearman等級采用相關分析雙側檢驗。

2 結果

2.1 DNMT1在正常宮頸組織和宮頸癌組織中的表達DNMT1表達于細胞質和（或）細胞核中，陽性染色為淡黃色、棕黃色或棕褐色顆粒。見圖1。

圖1 宮頸癌組織及正常宮頸組織免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of cervical cancer tissues and normal cervical tissues

2.2 癌組織、癌旁組織及正常組織中DNMTI陽性細胞百分比宮頸癌組織中DNMT1陽性細胞百分率顯著高于正常宮頸組織，差異具有統計學意義（P＜0.000 1），同時比較宮頸癌旁組織及正常宮頸組織中DNMT1的陽性細胞百分比，可見癌旁組織顯著高于正常宮頸組織，差異具有統計學意義（P＜0.000 1）。宮頸癌組織中DNMT1細胞陽性百分比顯著高于正常宮頸組織，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 癌組織、癌旁組織及正常組織中DNMTI陽性細胞百分比Fig.2 The percentage of DNMTI-positive cells in cancerous，paracancerous and normal tissues

2.3 宮頸腺鱗癌及正常宮頸組織中DNMT1陽性細胞百分比宮頸鱗狀細胞癌中DNMT1陽性細胞百分比顯著高于癌旁組織及正常宮頸組織，差異具有統計學意義（均P＜0.05）。宮頸腺細胞癌中DNMT1陽性細胞百分比顯著高于正常宮頸組織，差異具有統計學意義（P＜0.000 1），而與癌旁組織間無明顯差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖3。

圖3 宮頸腺鱗癌及正常宮頸組織中DNMT1陽性細胞百分比Fig.3 The percentage of DNMT1 positive cells in cervical adenosquamous carcinoma and normal cervical tissue

2.4 宮頸腺鱗癌及正常組織中DNMT1強度得分宮頸腺細胞癌AC中DNMT1強度得分顯著高于正常宮頸組織，差異具有統計學意義（P＜0.001），而與癌旁組織間差異無統計學意義（P＞0.05），宮頸鱗狀細胞癌SCC中DNMT1強度得分顯著高于癌旁組織及正常宮頸組織，差異具有統計學意義（P＜0.05，P＜0.001）。見圖4。

圖4 宮頸腺鱗癌及正常宮頸組織中DNMT1強度得分Fig.4 DNMT1 intensity score in cervical adenosquamous carcinoma and normal cervical tissue

2.5 DNMT1不同表達程度生存曲線選取陽性細胞百分比77.5%及評分1.394 6作為標準進行比較，消除人數所占比帶來的影響。如圖5該標志物表達水平低的女性相比，DNMT1陽性細胞百分比高于77.5%，DNMT1評分高于1.394 6的死亡率高4.174倍（P=0.041 1）。

圖5 DNMT1不同表達程度生存曲線Fig.5 DNMT1 survival curves of different degrees of expression

3 討論

在低收入甚至高收入國家均沒有發現宮頸癌有明顯的下降趨勢［7]。在全球，宮頸鱗癌是主要的組織學類型，約占宮頸癌的四分之三［8-9]。HPV感染被認定為是宮頸癌的主要致病因子，但鱗癌（87%）比腺癌（62%）的陽性率更高［10]。基于HRHPV陽性率的差異，與宮頸鱗癌相比，腺癌E6/E7的表達程度可能較低。因此與鱗癌相比，腺癌結合和上調DNMT1以及DNMT1的表達也可能更低。與正常宮頸組織相比，癌組織中DNMT1的較高表達也可以通過這種現象來解釋，與正常組織相比，癌組織更可能有表達E6/E7的HPV感染。

作為一種常見的表觀遺傳修飾形式，DNA甲基化在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中發揮著重要作用。盡管癌細胞甲基化機制缺陷的確切性質尚不清楚，但認為與DNMTs的表達有關，在哺乳動物中DNMTs主要為DNMT1、DNMT3A、DNMT3B［11]。已經證明DNMT1可以高度親和地識別和結合DNA損傷，例如堿基錯配，尿嘧啶和其他不尋常的DNA構象，這些病變被認為存在于人類癌性病變中［12-13]。這也可以用來解釋與正常宮頸相比宮頸癌組織中DNMT1的表達更高。

基于使用表觀遺傳改變作為治療藥物的表觀遺傳學治療越來越被認為是用于癌癥治療的主流方法。DNA甲基化是一個基因可以脫甲基化的可逆過程，可恢復到原來的狀態，由于DNA甲基化的這種可逆性，已經研究了DNMTis作為抗癌劑，因為它們能夠恢復已表達的基因DNMT的活性［14-15]。食品和藥物管理局（FDA）批準的DNMTis包括分別在2004年和2006年開發的阿扎胞苷和地西他濱，已被用于治療骨髓增生異常綜合征［17]。多個研究已經鑒定了在宮頸癌細胞中DNA甲基化在表觀遺傳學上失調的幾種機制的差異。然而目前還沒有研究評估DNMT1在宮頸癌中的表達，導致基于DNMTs治療宮頸癌的表觀遺傳療法尚處于起步階段。一些研究評估了DNMTs在癌組織中的表達，特別是DNMT1，并且報道了肺癌［18]，胰腺癌［19]中的表達水平或其與總體生存期較短的關聯。在本研究中，筆者證明在宮頸癌細胞中DNMT1的表達顯著高于正常或非癌細胞，表明DNMTis可能是宮頸癌的有效和靶向治療。筆者觀察到DNMT1的高表達與不良存活率結果顯著相關，這進一步確保單獨使用DNMTis或聯合免疫治療將是一種改善診斷為宮頸癌的女性的存活的新方法。

盡管HPV的致癌基因有上調DNMT1的能力，如結腸直腸癌中的腺瘤性息肉病基因（APC）中DNMT1受高危HPV的獨立途徑調節［20]，但依舊可能有其他機制存在。這種途徑是否在宮頸癌中起作用是未知的，但是HPV癌蛋白對DNMT1的上調作用表明DNMT1應該被作為宮頸癌治療的靶目標。筆者觀察到DNMT1在宮頸鱗癌中的表達高于宮頸腺癌，并且表達越高患者的預后越差。本研究的優點在于筆者詳細的分析了正常宮頸組織、癌組織及癌旁組織中DNMT1的表達及相關協變量調整后的生存結果。由于缺乏信息，比如患者的體重，是否有其他疾病，治療的周期及劑量，本研究存在一定的不足。另外只研究了DNMT1而不是所有DNMTs使本研究具有一定的局限性，下一步筆者將繼續研究DNMT1外的DNMTs與宮頸癌的相關性，以期更深入的了解宮頸癌的預后與DNMTs的關系。

綜上所述：宮頸癌組織中DNMT1陽性細胞率及強度得分均顯著高于正常組織及癌旁組織。隨著癌組織中DNMT1陽性細胞百分率的提高及強度的分的增高，宮頸癌的結局變的更差。