雙孢蘑菇酶解液的制備及GC-MS分析

程艷芬，井衛青，馮翠萍

（山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中 030801）

國內外研究表明，酶法水解可以改善食品的營養吸收特性及風味[1-3]。目前，食用菌酶法水解的研究多集中在蛋白質、多糖、黃酮和水溶性膳食纖維的提取及抗氧化等功能性質和相關產品開發方面[4-7]，對酶法水解后食藥用菌的風味特征和揮發性成分研究較少。雙孢蘑菇（Agaricus bisporus）因其風味獨特、營養豐富而在全球范圍均有種植和消費[8]，在加工過程中風味會迅速改變。熱加工過程中，雙孢蘑菇中醇的含量顯著降低，而酮和酸的含量則明顯增加[9]。單純煮沸的雙孢蘑菇湯中揮發性成分的數量顯著高于煮沸加蒸壓蘑菇湯中的揮發性成分[10]。冷凍干燥、熱風干燥和微波真空干燥的加工方式對雙孢蘑菇的揮發性成分的影響與熱加工方式一致。雙孢蘑菇子實體酶解液中揮發性風味物質的研究較少。

為探討新鮮的雙孢蘑菇子實體酶解液中的揮發性風味成分，試驗采用堿性蛋白酶（Alkaline protease）、纖維素酶（Cellulase）、堿性蛋白酶復合纖維素酶對新鮮雙孢蘑菇子實體進行水解。設計L9（34）正交試驗考查溫度（A）、pH值（B）、酶添加量（C）和時間（D） 對雙孢蘑菇蛋白水解度（DH） 的影響。利用氣相色譜-質譜聯用技術（GC-MS） 對雙孢蘑菇蛋白水解度最高的酶解液中揮發性成分進行分析。為研究雙孢菇酶解后特有風味的形成機理和功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

雙孢蘑菇，山西鼎昌農業科技有限公司提供；其他試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 雙孢蘑菇預處理

選擇新鮮白色、沒有腐爛變質和嚴重褐變的雙孢蘑菇，切塊，浸于護色液（0.6%檸檬酸+0.3%氯化鈉+0.05%抗壞血酸） 中約30 min。料液比為1∶2，勻漿機打漿備用。

1.2.2 Cellulase水解雙孢蘑菇參數的篩選

Cellulase正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 Cellulase正交試驗因素與水平設計

按照表1所列的四因素三水平對雙孢蘑菇處理，處理完成后將雙孢蘑菇樣液取出，加入50 mL蒸餾水，搖勻后緩緩加入Zn（CH3COO）2溶液5 mL和K4Fe（CN）6·3H2O 溶液 5 mL，然后定容至 100 mL，靜置，以轉速3 000 r/min離心10 min，取上清液。計算還原糖的含量[11]。

1.2.3 Alkaline protease酶解雙孢蘑菇參數的篩選

Alkaline protease正交試驗因素與水平設計見表2。

表2 Alkaline protease正交試驗因素與水平設計

按照表2所示對雙孢蘑菇處理，處理完成后，記錄室溫下恢復至原始pH值所消耗0.1 mol/LNaOH的體積，并計算DH[12]。

1.2.4 Alkaline protease復合Cellulase對雙孢蘑菇的酶解

在上述1.2.3測得的條件下，先用Alkaline protease水解雙孢蘑菇子實體，再在1.2.2測得的條件下，用Cellulase水解，測定最終酶解液的DH。與1.2.3測得的DH相比，取DH大的酶解產物進行GC-MS分析。

1.2.5 GC-MS試驗條件

根據參考文獻[13]進行試驗條件的設置，對部分條件進一步改進：色譜柱為DMNI-MS型毛細管柱（30 m×250 μm 0.25 μm）；柱溫 45 ℃，保持 2 min，以6℃/min上升至240℃，保持5 min。進樣口溫度270℃，流速1 mL/min，無分流。離子源溫度280℃，掃描質量范圍35～600。

2 結果與分析

2.1 Cellulase水解雙孢蘑菇最佳參數的確定

Cellulase水解雙孢蘑菇的正交試驗結果見表3。

由表3可知，還原糖含量最高的組合為A2B2C3D1，各個因素對雙孢蘑菇酶解后還原糖含量的影響依次為B＞C＞D＞A。測得各因素的最優水平組合A1B2C3D2條件下，雙孢菇的酶解液中還原糖含量為2.04%，高于A2B2C3D1。因此，Cellulase水解雙孢菇的最佳參數確定為A1B2C3D2，即酶解溫度50℃，pH值5.0，酶添加量0.8%，時間120 min。

表3 Cellulase水解雙孢蘑菇的正交試驗結果

2.2 Alkaline proteas水解雙孢蘑菇最佳參數確定

研究表明，以DH作為評價指標時，Alkaline proteas是從5種不同的蛋白酶中篩選出來的水解雙孢蘑菇的最佳蛋白酶[14]，因此選用Alkaline proteas。

Alkaline protease酶解雙孢蘑菇的正交試驗結果見表4。

表4 Alkaline protease酶解雙孢蘑菇的正交試驗結果

由表4可知，DH最高的處理組合為A'2B'3C'1D'3，各因素對雙孢蘑菇的水解液中DH的影響依次為B'＞C'＞D'＞A'。測得因素的最優水平組合 A'2B'3C'2D'3條件下雙孢蘑菇酶解液DH均值為18.27%，高于A'2B'3C'1D'3。因此，最佳方案確定為溫度40℃，pH值10.5，酶添加量0.9%，時間150 min。

2.3 Alkaline proteas復合Cellulase水解雙孢蘑菇結果

在上述篩選出的最佳條件下，用Alkaline proteas復合Cellulase酶解雙孢蘑菇，做3次重復，測得DH分別為21.30%，20.98%，20.12%。將該結果與雙孢蘑菇Alkaline proteas酶解液的DH進行方差分析。方差分析見表5。

表5 方差分析

由表5可知，F值為31.5，大于方差分析表中F0.05（1，4）=7.71，F0.01（1，4）=21.20，差異極顯著。因此，選擇雙孢蘑菇復合酶水解雙孢蘑菇的酶解液進行GC-MS分析。

2.4 雙孢蘑菇酶解產物揮發性成分的GC-MS分析

雙孢菇酶解產物揮發性成分的GC-MS見圖1，雙孢蘑菇酶解產物揮發性化合物組成及其含量見表6，酶解后的雙孢蘑菇中揮發性化合物的種類及相對含量見表7。

圖1 雙孢菇酶解產物揮發性成分的GC-MS

表6 雙孢蘑菇酶解產物揮發性化合物組成及其含量

表7 酶解后的雙孢蘑菇中揮發性化合物的種類及相對含量

通過GC-MS測得雙孢蘑菇水解產物中的揮發性成分33種，總的相對含量為77.81%，其組成和含量列于表6中，其中的1-辛烯-3-醇的相對含量最高為33.37%，其次為芐醇13.67%，苯甲醛11.38%，3-辛酮4.91%，均為C8類化合物，結果與其他食用菌香味的報道一致。不管是新鮮雙孢菇，還是煮沸、干燥或水解后的雙孢菇，C8化合物對其鮮味影響最大。將表6中的化合物進行分類整理，結果如表7所示，雙孢蘑菇酶解液中醛類物質種類最多，有10種，相對含量為20.50%；醇類物質的種類有8種，但其相對含量為49.86%，最高。其次為酮類物質，共6種。還含有少量的烷烴、烯烴、苯類、含氮化合物等。此外，酶解后的雙孢蘑菇中還含有2種吡嗪類化合物，相對含量0.27%，與美拉德反應有關，熱加工和干燥處理沒有檢測到該物質。酶解后，醛酮類揮發性物質的種類增加，酯類物質的種類減少可能是由于新鮮雙孢菇子實體中的酸類和酯類物質在酶解條件下降解成醛酮類物質。

3 結論

纖維素酶水解雙孢菇子實體的最佳參數為溫度50℃，pH值5.0，酶添加量0.8%，時間120 min；堿性蛋白酶水解雙孢菇子實體的最佳條件為溫度40℃，pH值10.5，酶添加量0.9%，時間150 min。用復合酶水解雙孢菇子實體后，DH為20.80%，其中有33種揮發性化合物。