復合酶促桂花酒澄清工藝研究

周 偉，駱德偉

（1.杭州頂津食品有限公司，浙江杭州 310018；2.吉首大學化學化工學院，湖南吉首 416000）

0 引言

桂花酒（Chinese rice wine） 是以糯米和金桂花等為主要原料，經蒸煮、加曲、糖化、發酵、壓榨、澄清、過濾、煎酒、貯藏和勾兌而成的釀造酒。它酒性醇和、營養豐富，其含有的糖、肽、氨基酸等低分子浸出物和微量元素易被人體消化吸收，是深受人們喜愛的滋補酒、飲料酒和調味酒。但由于桂花酒的營養成分特別豐富，酒體中含有較多的蛋白質、多酚（單寧）、脂肪、焦糖色素和多糖等大分子成分，酒體貯存期間較易發生混濁、沉淀，傳統的棉餅、硅藻土或紙板過濾往往很難獲得理想的澄清效果[1-2]。因此，結合傳統工藝，利用木瓜蛋白酶和果膠酶復合酶法對酒體進行澄清處理，以提高桂花酒的穩定性及品質[3-5]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

傳統手工桂花酒，3年陳釀，購于湖南省懷化市洪江區；木瓜蛋白酶（酶活力50 000 U/g）、果膠酶（酶活力100 000 U/g），江蘇銳陽生物科技有限公司提供；乙酸、碳酸氫鈉，均為分析純。

1.2 儀器與設備

HH-S2型恒溫水浴鍋，金壇市成輝儀器廠產品；FA2004型電子天平，上海舜宇恒平科技儀器有限公司產品；OU-2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司產品；U/GZX-9070 MBE型鼓風干燥箱，上海博訊實業有限公司醫療設備廠產品；PHSJ-4A型pH計，上海精密科學儀器有限公司產品；5810R型臺式冷凍離心機，德國艾本德公司產品。

1.3 樣品檢測與工藝流程

1.3.1 桂花酒的酶處理澄清工藝流程

酶處理桂花酒的澄清工藝流程為：使用碳酸氫鈉溶液或乙酸對樣品桂花酒進行pH值調試，加入相應濃度的酶，在適當溫度條件下進行反應，一段時間后使用臺式冷凍離心機以轉速6 500 r/min離心10 min，于波長660 nm處的吸光度（吸光度即表示澄清度）[6]。

1.3.2 樣品pH值和吸光度檢測

檢測桂花酒pH值和吸光度（即于波長660 nm處所測吸光度）。

1.3.3 木瓜蛋白酶的單因素試驗

（1）酶添加量。將樣品酒調至pH值為4，酶添加量依次為0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，并在溫度50℃條件下3 h水浴處理后，測定其吸光度。

（2） pH值。取調節pH值后的桂花酒，木瓜蛋白酶酶解能力在偏酸性條件較強，因此pH值分別為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，在已確定酶添加量的基礎上，桂花酒在酶解溫度50℃，處理3 h后，測定其吸光度，確定pH值。

（3）酶處理溫度。改變木瓜蛋白酶處理的溫度40，45，50，55，60℃，在已確定的條件基礎上，酶反應時間3 h，測定其吸光度。

（4）酶反應時間。取前面的其他因素的最佳條件下進行酶反應時間1，2，3，4，5 h的確定。1.3.4 果膠酶的單因素試驗[7]

（1） 酶添加量。將樣品桂花酒調至pH值為4，加入酶添加量依次為0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，在酶反應溫度50℃，處理3 h后，測定其吸光度。

（2） pH值。取桂花酒相應pH值（果膠酶的作用pH值為2.5～6.0），由于過酸性影響酒的口感和氣味，所以選擇pH值的范圍為3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，在酶添加量確定的條件下，酶反應溫度50℃，處理3 h后，測定其吸光度。

（3）酶處理溫度。改變果膠酶的處理溫度40，45，50，55，60℃，在酶添加量和pH值確定的條件下，反應3 h后測定其吸光度。

（4） 酶反應時間。取其他因素的最佳條件（酶添加量0.5%，反應溫度40℃，pH值3） 改變酶反應時間1，2，3，4，5 h，并測定其吸光度。

2 結果與分析

2.1 木瓜蛋白酶處理樣品酒的單因素的確定

2.1.1 酶添加量對澄清度的影響

木瓜蛋白酶添加量對澄清度的影響見圖1。

圖1 木瓜蛋白酶添加量對澄清度的影響

由圖1可知，木瓜蛋白酶處理桂花酒樣品的澄清效果隨著酶添加量的增加而變化，樣品的澄清度在酶添加量為0.5%時達到最佳。由試驗結果可得，在酶添加量比較小時，酶的處理達不到有效的效果，反而會使桂花酒更加渾濁；反之酶添加量過大，雖然有澄清效果，但是成本過高。綜合各方面的因素，同一條件下進行木瓜蛋白酶的處理，因此選擇酶添加量0.5%左右。

2.1.2 桂花酒pH值對澄清度的影響

桂花酒pH值對木瓜蛋白酶澄清效果的影響見圖2。

圖2 桂花酒pH值對木瓜蛋白酶澄清效果的影響

由圖2可知，在相同條件下對桂花酒進行pH值調節，隨著pH值的不斷增加，酒體的澄清度也在不斷下降，在pH值為3時，桂花酒的澄清度最高。因此，在相同酶添加量時，pH值為3時澄清效果最佳。

2.1.3 酶處理溫度對澄清度的影響

木瓜蛋白酶處理溫度對澄清度的影響見圖3。

圖3 木瓜蛋白酶處理溫度對澄清度的影響

由圖3可知，得到桂花酒的澄清度隨著處理溫度的不斷變化而發生波動，酶處理溫度為40℃時，其澄清效果最佳。

2.1.4 酶反應時間對澄清度的影響

木瓜蛋白酶反應時間對澄清度的影響見圖4。

在各條件達到最優條件時，酶反應4 h時桂花酒的澄清度達到最佳。因此，在單因素試驗中所得最佳條件為酶添加量0.5%，pH值3，在酶處理溫度40℃條件下處理4 h時的澄清度為最佳。

圖4 木瓜蛋白酶反應時間對澄清度的影響

2.2 果膠酶處理樣品酒的單因素的確定

2.2.1 酶添加量對澄清度的影響

果膠酶酶添加量對澄清度的影響見圖5。

圖5 果膠酶酶添加量對澄清度的影響

由圖5可知，樣品桂花酒的澄清度在不斷變化，澄清度在酶添加量為0.5%時達到最佳。由試驗結果可得，在酶添加量比較小時，酶的處理達不到有效的效果，會使桂花酒渾濁；反之酶添加量過大，雖然有澄清效果，但是成本過高。綜合各方面的因素，選擇酶添加量為0.5%左右。

2.2.2 桂花酒pH值對澄清度的影響

桂花酒pH值對果膠酶澄清效果的影響見圖6。

圖6 桂花酒pH值對果膠酶澄清效果的影響

由圖6可知，調節樣品pH值在相同條件下對溶液進行處理，隨著pH值的不斷增加，桂花酒的澄清度也在不斷下降，在pH值為4.5時，溶液的澄清度最高。因此，在pH值為4.5時，添加同等酶添加量對樣品的澄清效果最佳。

2.2.3 酶處理溫度對澄清度的影響

酶處理溫度對澄清度的影響見圖7。

圖7 酶處理溫度對澄清度的影響

經過對酶處理溫度的單因素試驗，得到酒體的澄清度隨著酶處理溫度的不斷變化而發生波動，當酶處理溫度為40℃時，桂花酒的澄清效果最佳。

2.2.4 酶反應時間對澄清度的影響

果膠酶反應時間對澄清度的影響見圖8。

圖8 果膠酶反應時間對澄清度的影響

當各條件為最優條件時，樣品酒的澄清度反應4 h時達到最佳。因此，在單因素試驗中所得最佳條件為酶添加量0.5%，pH值4.5，在酶處理溫度40℃條件下反應4 h時的澄清度為最佳。

2.3 正交試驗設計

在木瓜蛋白酶處理樣品酒的單因素試驗中得出，最佳的條件為酶添加量0.5%，酶處理溫度40℃，酶反應時間4 h，pH值3時，酒體的澄清效果最好；而果膠酶處理樣品酒的單因素試驗中得出，最佳的條件為酶添加量0.5%，酶處理溫度40℃，酶反應時間4 h，pH值4.5時，酒體的澄清效果最好。因此，木瓜蛋白酶和果膠酶處理樣品酒的正交試驗表中各因素確定為在單因素試驗中得到的最佳條件為參照值，成為1個五因素四水平的正交表。

不同因素作用下的澄清度正交試驗設計見表1，不同因素作用下的澄清度正交試驗結果見表2。

2.4 復合酶澄清工藝的優化

正交試驗結果表明，5個影響因素的R大小排列為E＞B＞D＞C＞A，由此可見，極差R越大對試驗效果的影響越大，即對桂花酒的澄清度的影響越大，即pH值＞酶處理溫度＞酶反應時間＞酶添加量＞酶量比。最佳的試驗方案為A2B4C1D1E4，即最佳的復合酶澄清傳統手工桂花酒的工藝條件為酶處理溫度50℃，pH值4.5，酶添加量0.1%，酶反應時間1 h，酶量比1∶2。在此最佳條件下的澄清度為0.015，在原酒的條件上提高了28.6%。

表1 不同因素作用下的澄清度正交試驗設計

表2 不同因素作用下的澄清度正交試驗結果

3 結論

根據試驗結果可知，對木瓜蛋白酶4個影響因素的單因素試驗結果為酶添加量0.5%，酶處理溫度40℃，酶反應時間4 h，pH值3時，澄清度最低，澄清效果最好；果膠酶的單因素試驗中得到酶添加量0.5%，酶處理溫度40℃，酶反應時間4 h，pH值4.5時澄清效果最好。影響復合酶處理和澄清桂花酒5個因素影響的正交試驗結果為pH值＞酶處理溫度＞酶反應時間＞酶添加量＞酶量比，即最佳提取工藝條件為酶處理溫度50℃，pH值4.5，酶添加量0.1%，酶反應時間1 h，酶量比1∶2，此時桂花酒的澄清度提高了28.6%。