適度破碎微藻細胞釋放 功能性蛋白的技術研究進展

曾劍華,楊 楊,石彥國,辛嘉英,2,*

(1.哈爾濱商業大學,食品科學與工程重點實驗室,黑龍江哈爾濱 150076; 2.中國科學院,蘭州化學物理研究所羰基合成和選擇氧化國家重點實驗室,甘肅蘭州 730000)

近年來,人口的激增增加了人們對能源、食品等資源的需求,諸如石油、天然氣等不可再生資源面臨著巨大的壓力;微藻具有生長速度快、產量高及不占耕地等特性[1],且能緩解溫室效應[2];在開發生物柴油能源方面具有廣闊的前景,是不可再生資源替代品;同時微藻蛋白等活性物質作為保健品、藥品和化妝品等行業的原料來源也具有很大潛力,因此微藻成為國內外研究熱點[3-4];微藻的主要功效成分包括多不飽和脂肪酸、多糖、蛋白質等[5-8];而促進健康作用的大多數功能組分與蛋白質或肽相關[9];因此,具有廣譜生物學特性如抗高血壓、抗腫瘤以及治療心血管疾病的微藻生物功能蛋白質和肽類備受關注[10-11]。

微藻細胞壁的結構和組成對胞內生物分子的釋放和提取有重要影響[12-15]。例如,螺旋藻細胞壁是由肽聚糖組成,其穩定性比細胞壁由纖維素組成的微擬球藻和二形柵藻差,微藻破壁后蛋白提取率為74%;但是二形柵藻有雙層細胞壁結構,細胞壁較堅固,其蛋白質得率最低僅為17%[16]。可見微藻細胞輕度破碎技術的選擇與微藻細胞壁的結構特征有關。目標物質的數量和質量也與細胞破碎方式密切相關[15-18],為突破這一限制,首先必須采取適當的技術破碎細胞壁打開細胞膜,最大限度地釋放目標物質。

此外,細胞破碎技術的選擇除了考慮微藻復雜的細胞壁結構外,很大程度上還取決于目標物質的功能性質[19]。采取輕度細胞壁破碎技術,從微藻中獲得可觀的蛋白質提取率同時還能保持蛋白質的生物活性[20];由此,基于微藻的生物煉制技術可以實現將生物質轉化為各種高附加值產品[21]。

微藻作為多種生物制品原料具有很大潛力,但其剛性細胞壁阻礙了胞內物質的有效釋放,至今對輕度破碎微藻細胞釋放蛋白質等活性物質尚無高效技術,因而微藻的商業化應用尚處于初級階段[22]。目前,國內外多數研究致力于開發具有經濟效益的微藻上游加工技術[23-24],微藻在生物燃料方面研究成果頗豐[25-26],而關于微藻輕度細胞破碎和生物功能蛋白質的回收方面報道還較少[12,27]。這也是微藻深加工利用的瓶頸所在;本綜述探了微藻的輕度細胞破碎方法釋放功能性蛋白質的最新進展和研究方向,對傳統和新興的輕度細胞破碎技術進行比對分析,提出今后可能的發展方向。

1 微藻概述

1.1 微藻的類型

微藻(microalgae)是一類單細胞生物,海洋和淡水均存在微藻,直徑通常小于1 mm;根據生長規模,藻類分為兩類:微藻類和大型藻類;根據營養方式可分為三類,即自養、異養和混合營養[19]。大多數微藻是自養的,在適宜的光照條件下,能利用二氧化碳和無機營養物質等進行代謝活動產生有機化合物,如碳水化合物、脂肪和蛋白質等[2-3]。異養與自養相反,它們不能固定碳,因此需要提供有機碳源,例如葡萄糖等,作為生命代謝能量來源;微藻的異養培養是高附加值化合物原料的主要來源[28]。大規模培養用于商業化的藻類稱為商業微藻,包括四個微藻屬,綠藻門(Chlorophyta)、紅藻門(Rhodophyta)、定鞭藻門(Haptonema)和原生藻屬(Catenella)[29]。

1.2 微藻的主要成分

微藻含有蛋白質、脂質、碳水化合物、色素、無機鹽以及維生素等成分;主要成分為蛋白質、碳水化合物和脂質。表1為常見食物和藻類組成成分表。據研究顯示,蛋白質是微藻生物量的主要成分(通常為干重的40%～60%),其次是脂質和碳水化合物。微藻具有合成所有類型氨基酸的能力,能提供人體所需的所有必需氨基酸,由此,微藻蛋白在某種程度上優于大多動植物蛋白。微藻蛋白在保健品、藥品等行業的應用也越來越廣泛[30]。

表1 常見食物和藻類組成成分(%,干重)Table 1 General composition of different algae and common food(%,DW)

1.3 微藻細胞壁

細胞壁是保持細胞完整性以及抵御入侵者和在惡劣環境下的主要保護屏障。結構復雜的細胞壁通常是由多糖(如纖維素)、果膠、甘露糖、木聚糖、礦物質(鈣、鎂或硅酸鹽)、蛋白質(如糖蛋白)等組成,具有機械強度高且化學耐性強等特點[31]。藻類細胞壁的組成和結構是復雜多變的,從微小單層細胞膜到多層復合嵌套結構;了解藻類細胞壁結構性質對生物破碎具有重要意義,可以有針對性地選擇適宜的輕度細胞破碎技術,以增大提取率和更好的保護目標產物的生物活性;但是大多數微藻細胞壁結構性質仍不是很清楚[32]。表2為4種常用微藻的細胞壁特征、主要成分及其主要用途。

表2 4種微藻細胞壁特征、成分及其主要用途[14,33]Table 2 Characteristics and components of four microalgae cell walls and their main applications[14,33]

2 微藻蛋白的功能及其應用

微藻蛋白具有抗氧化、抗高血壓、抗腫瘤等多種功能,食品、保健品、藥品和化妝品等行業具有廣泛的應用前景。

微藻蛋白質在數量和質量方面與大豆、雞蛋和魚類等常規食品蛋白相當、甚至更好,且微藻蛋白的氨基酸含量均衡,而被認為是蛋白質的重要替補來源。目前,微藻蛋白以藻類生物質的形式或作為提取的蛋白質形式,已經用于食品和飼料中。如,螺旋藻、小球藻、杜氏鹽藻等藻類蛋白作為食品添加劑已被美國食品藥品監督管理局(FDA)認可[33];利用杜氏鹽藻生產β-類胡蘿卜素制成添加劑用于產蛋雞的飼料中,可以使蛋黃顏色更鮮艷[34]。

微藻蛋白用于化妝品產品的開發也具有很大的發展潛力,目前關于螺旋藻、小球藻和杜氏鹽藻等藻類蛋白水解產生的類菌孢素氨基酸(MAAs)的研究顯示,(MAAs)可以減少紫外線對皮膚的傷害,表明MAAs具有一定的抗氧化作用[35-36]。

微藻蛋白不僅用于飼料、食品和化妝品行業,研究表明,由于蛋白質及其水解產物或濃縮物和肽產品能夠抑制腎素、血管緊張素、醛固酮系統(RAAS)內的酶并降低血壓[37]。此外,在紫外線照射皮膚成纖維細胞試驗研究中,用小球藻蛋白衍生的肽混合物(5、10 mg/L)處理的皮膚細胞在72 h內顯示出100%的細胞保護作用[38];小球藻蛋白質水解產生的五肽(Leu-Asn-Gly-Asp-Val-Trp)在體外過氧自由基和DPPH自由基清除實驗,以及猴腎細胞中的細胞內自由基清除活性顯示具有強烈自由基清除能力[39]。因此蛋白質、蛋白質水解濃縮物和肽產品具有抗氧化、抗高血壓等功效，其在藥品工業中的應用也越來越多。

基于微藻活性物質多種功能特性,微藻蛋白或將進一步用于抗病毒研究如埃博拉病毒、HIV病毒的研究。已有關于微藻代謝物用于HIV病毒的研究報道。例如Deniz等[40]研究顯示,螺旋藻水提取物能抑制人T細胞系外周血單核細胞和郎格爾漢細胞中HIV-1 的復制。Matip等研究表明每日平衡膳食組合補充螺旋藻飲食已顯著增加了CD4細胞和6個月后 HIV病毒量顯著降低[41]。

3 微藻輕度破碎技術

微藻的生物降解受到剛性細胞壁的限制,為促進胞內物質釋放,尤其是微藻生物活性物質如蛋白質、多不飽和脂肪酸、色素等的溶出,必須對微藻細胞壁進行降解甚至破碎。微藻是真核細胞,其細胞壁與原核細胞不同,細胞壁韌性對機械破碎和化學破碎具有相當大的抵抗力。加大機械或者化學破碎力度雖能促進胞內物質的釋放,但是這勢必影響微藻蛋白等活性物質的活性;同樣機械破碎力度增大會增加能耗而增加經濟成本;由此,輕度細胞破碎技術成了關鍵,既要最大限度釋放胞內物質以獲得最大回收率,又要保持微藻蛋白的生物活性,還要考慮技術的擴大及經濟可行性。

在傳統細胞破碎的方法基礎上,基于提取胞內活性物質原則篩選出溫和的輕度細胞破碎技術;根據細胞破碎技術發展將其分為傳統現有技術和新興潛在細胞破碎技術。從傳統細胞破碎技術中挑選出珠磨法、高壓勻漿技術、超聲法、離子液體和酶解法的作為代表;選擇流體空化技術、微流法、脈沖處理技術和陽離子聚合物涂抹法作為潛在的微藻細胞破碎技術代表。

3.1 現有溫和、輕度細胞破碎技術

3.1.1 珠磨法 珠磨法一種機械細胞破碎方法,所用設備為球磨機,小球直徑通常小于1 mm;經過攪拌器使得微藻細胞懸液與珠子之間充分混合,通過珠子與細胞之間的互相碰撞、剪切,造成細胞壁破裂促進胞內物質溶出[42]。珠磨法由于細胞破碎率高、通量高以及良好的溫度控制而備受關注,且勞動力強度低、細胞破碎連續化程度高,易于工業化實施。市售設備最常見的設計如圖1所示。球磨機軸可以攜帶不同設計(同心或偏心盤或環)的攪拌器,將動能輸出到腔室中的小鋼珠、玻璃珠或陶瓷珠[1]。

圖1 球磨機閥座示意圖Fig.1 Valve seat schematic of bead mill

細胞破碎之后,珠子可通過重力從攪拌溶液中分離。在處理熱敏產品時,在中斷過程中需要有效的冷卻裝置,防止蛋白質等活性物質變性失活。因球磨機研磨室配有冷卻裝置,其摩擦熱可以通過冷卻盤管去除,被認為是生物煉制的有效的輕度破碎技術。

目前,珠磨法主要用于研究微藻細胞的脂質提取,因而少有研究者關注珠磨法溫和的細胞破碎條件[20]。迄今為止,使用珠磨機溫和、輕度破碎微藻細胞壁釋放微藻蛋白等活性成分的研究已有報道[42]。Safi等[43]在微擬球藻細胞破碎能耗及水溶性蛋白溶出的研究表明,珠磨法在20 min內細胞破碎率達到95%以上,蛋白質提取率為53%。值得注意的是,蛋白質釋放的一級動力學常數(k=1.2 min-1)是細胞破碎動力學常數的6倍(k=0.21 min-1),表明細胞完全破碎不是完全釋放細胞內蛋白質的先決條件;修正一階動力學模型后的比能量輸入為0.43 kWh/kg生物量。此外Postma等[44]關于用珠磨法破碎微藻細胞壁的珠粒直徑大小研究表明,珠粒直徑減小,蛋白質釋放率呈增大趨勢,能量呈下降趨勢;當珠粒直徑為0.4 mm時,小球藻破碎率達97%,蛋白質提取率最大,為57%,能耗為0.72 kWh/K WD。減小珠粒的尺寸將同時增加珠粒和細胞之間的接觸面積,因此,細胞破碎將加速且能量輸入降低。最新研究成果均比之前Postma[45]等用珠磨法得到小球藻蛋白質提取率(30%～42%)要高。

珠磨機雖然可以實現高效率的細胞破碎,也能連續生產化;但是當大規模應用時,該技術將消耗大量的能量。操作參數如轉速、進料速度、珠子直徑與用量以及參數之間的內在聯系等也會對細胞破碎效率產生影響,從而影響細胞破碎過程的總體成本。

3.1.2 高壓勻漿法(HPH) HPH法已廣泛應用于乳制品行業以減少乳化脂肪微粒的大小以及滅菌處理,因此可應用于高濃度(20%～25%,w/w)的藻類糊劑[46]。HPH特別適用于具有剛性細胞壁的微藻細胞破碎;在高壓勻漿閥座單元中,在高壓室(150～400 MPa)細胞懸浮液被迫流過中心小孔,撞擊沖擊環,被迫改變方向從出口管流出;在閥座和沖擊環的硬表面上沖擊細胞形成湍流、高壓剪切力,之后壓力突然下降使得細胞內氣泡瞬間的釋放,同時伴隨流速下降而引起氣泡形成和崩潰的空化效應最終導致了細胞的破碎[46-47]。

HPH作為一種相對簡單的微藻細胞破裂技術,已經廣泛于微藻油脂的提取。Yap[47]等關于HPH用于微藻細胞破碎工業化的評估結果表明,在60 MPa、藻漿濃度25%(w/w)、三酰甘油(TAG)含量為30%的條件下,用高壓勻漿機破碎微擬球藻,能耗與產出比為0.06(MJHPH/MJTAG)。Coons等[48]研究發現高壓勻漿技術不適合微藻細胞破碎工業化應用。這兩個研究結論相反,差別在于Coons等研究的藻漿濃度為4%,而Benjamin等人研究的藻漿濃度為25%。Benjamin等人研究還發現,隨著藻漿濃度(<25% w/w)的增大,能耗呈下降趨勢,這大大降低了高壓勻漿的能量需求,其研究成果也為HPH工業化提取微藻脂質提供了有力的支持。

HPH很早就用于酵母細胞破碎和蛋白質回收[49];HPH作為輕度破碎技術用于微藻細胞破碎以及生物活性物質蛋白質釋放的研究報道也越來越多。Safi[12]等對比了高壓勻漿技術以及堿處理的方法提取五種微藻蛋白,結果顯示,HPH處理后的蛋白提取率均高于堿處理,HPH處理后水溶性蛋白溶出率最大值來自紫球藻為88%,最小值來自紅球藻為40%(27%);而堿處理后對應的蛋白溶出率分別為76%和27%;HPH處理對應的提取率分別為51%和41%。Safi[17]等通過手動研磨、超聲處理、化學處理以及高壓勻漿這四種技術對上述五種微藻進行細胞破碎,試驗結果同樣顯示,高壓勻漿技術擁有最高的蛋白質溶出率,最大值來自紫球藻90%,微擬球藻則為52%,最小值來自紅球藻41%;三種微藻蛋白提取率分別為53%、25%和21%。這些結果均表明HPH是微藻細胞破碎最有效的技術。為進一步證實高壓勻漿技是最適細胞破碎技術,Safi[43]等隨后對微擬球藻細胞破碎的能耗以及水溶性蛋白釋放進行研究,HPH細胞破碎率大于95%,蛋白質提取率則均在50%左右;HPH比能耗低至0.32 kWh/kg WD,該結果與Yap等[47]的研究結果相一致,為高壓勻漿技術微藻細胞破碎工業化應用提供了有力的數據支撐。

為進一步提高HPH處理微藻細胞破碎后的蛋白溶出,可以使用組合技術手段,如將HPH和酶處理等相結合以提高水溶性蛋白質的提取率。

3.1.3 超聲處理法 超聲波處理技術由于在處理低劑量樣品時操作簡便、損失較少,在實驗室已普遍應用于細胞破碎處理。超聲波能用于破碎細胞壁歸功于超聲波產生的微尺度渦流和高效傳質,以及氣泡的生成、變大到最后的破碎形成的空化效應。超聲波通過將微藻暴露于高強度的超聲波而引起細胞破裂,致使液體介質細胞產生微小的不穩定的空化氣泡,由于空化效應,氣泡爆炸產生沖擊波和能量,形成的高剪切力最終破壞剛性細胞壁并釋放胞內物質[50]。

超聲處理技術已被廣泛用于促進黃酮、多糖[51-52]等生物活性物質的溶出,且均顯示出良好的試驗結果。由此,超聲波處理技術被認為是一種有效的細胞破碎技術,進而被嘗試應用于微藻細胞破碎,期望可以加大胞內物質的溶出;然而近來的研究結果表明,單獨使用超聲處理技術效果并不是很理想。Zuhair[53]等用超聲提取微藻蛋白的結果顯示,在1000 W條件下超聲3 min,柵藻和萊茵衣藻的蛋白提取率能達到70%以上;其他藻類如微擬球藻和小球藻等效果較差,蛋白提取率在30%左右。該結果證實了,在大功率下超聲能對微藻細胞進行破碎。

超聲處理技術一般結合其他處理技術進行細胞破碎,從而獲得更好的結果。如Ruilin-Zhang等[54]使用不同技術組合提取微藻蛋白的研究結果表明,單一使用超聲技術在超聲功率600 W,超聲6 s,間隔9 s,處理30 min,蛋白質提取率為20%,遠大于Lee等[52]對小球藻蛋白的提取率(<10%)。凍融技術和超聲處理相結合,蛋白質提取率為23%;酶消化和超聲提取結合,蛋白提取率為30%;醇提、酶消化、超聲和均質提取組合,蛋白質提取率為72%。該結果遠優于Safi等[43]小球藻蛋白提取率為50%的研究結果;也是近年來小球藻蛋白提取率的最高的研究成果。不同的組合顯示了不同的蛋白質提取率,其機制尚不清楚,還有待于進一步研究。

3.1.4 離子液體處理法 細胞破碎可以由各種化合物如抗生素、螯合劑、離子液體、有機溶劑、次氯酸鹽、酸和堿引起。

有機溶劑萃取黃酮、多糖、色素等活性成分是常用化學方法,如Ruilin-Zhang等[54]的用在固液比為1∶10 (w/v),通過醇提、以及碳酸鈉提取24 h的研究結果顯示,醇提蛋白質提取率為28%;結果高于機械處理所得的蛋白質提取率。然而有機溶劑通常會使得蛋白質發生不可逆轉變性,因此處理過程要快,時間過長則導致失活。而離子液體處理蛋白質的變性是可逆的,且其能保持相對穩定的pH以及適宜的溫度。

離子液體是傳統溶劑的環保替代品,在0～140 ℃是液態的有機鹽,由大的不對稱有機陽離子和有機/無機陰離子組成。它們可以通過選擇陽離子或陰離子成分來調整特定的溶解度、電導率、極性和疏水性。此外,離子液體還具以下獨特性質:熔點低、揮發性極低、不可燃、熱穩定性和化學穩定性高的特點;且能夠將極性化合物溶解于非極性體系中[55]。這些特點使其成為常規溶劑的最佳選擇,因此可將離子液體處理法用于適度破碎微藻細胞。

Lee等[56]將離子液體緩沖液配合超聲處理破碎小球藻細胞提取和回收蛋白質結果顯示,在單獨使用3-(N-嗎啉)丙磺酸膽堿-鹽酸等離子液體緩沖液時,蛋白質回收率均低于10%;上清液的紫外譜圖在650 nm處有吸收峰,表明離子液體緩沖液對蛋白質并不是高度選擇轉一性,葉綠素在其中起到主要的干擾作用。而當3-(N-嗎啉)丙磺酸膽堿-鹽酸等離子液體緩沖液與超聲處理配合使用時,設定參數離子液體濃度為50 mmol/L、超聲時間為30 s、超聲功率為400 W以及藻漿濃度為6 g/L,蛋白質提取率為25.3% WD,蛋白質回收率達到95%。實驗結果較好,所用的試劑相對于傳統離子液體而言較便宜,且屬于可再生資源;有研究表明,回收的離子液體還再次用于細胞破碎,效果與新配制的離子液體等同[57],而且其能力不會隨著使用次數的加大而減少,這無異于給下游加工技術節約成本打開了一條新道路。但是如何回收3-(N-嗎啉)丙磺酸膽堿-鹽酸等離子液體也將成為一個問題。

3.1.5 酶處理法 酶由于處理條件溫和、選擇性高,同時也易于擴大生產規模,很早就被用于細胞破碎研究;但是酶處理成本相對較高,也不易于選擇轉一性很高的單一酶處理某一種微藻,這給微藻細胞破碎帶來了一定的困難。

酶處理由于具有溫和的技術條件以及良好的產出效果,被用于微藻細胞破碎及其蛋白質回收應用。Ruilin-Zhang等[54]用單一的纖維素酶處理小球藻提取蛋白質,結果顯示,蛋白質提取率僅為17%,其效果低于溶劑以及超聲提取。為進一步提高蛋白質提取率,將酶處理與機械處理技術相結合,得到酶處理與超聲處理組合的結果最高,蛋白質提取率為30%;繼續優化并增加組合得出,酶處理結合60%乙醇浸泡、超聲和均質處理時,蛋白質提取率達到最大值72%。

而Zuhair[53]等用溶菌酶和纖維素酶處理各種微藻提取蛋白質,研究結果顯示,溶菌酶處理16 h后的四種微藻蛋白質的回收率在79%～97%之間;顯示出更高的產率,這可能是由于溶菌酶和纖維素酶的專一性水解微藻引起的。Sierra等[27]用酶處理萊茵衣藻提取蛋白質和脂質的最新研究結果顯示,通過自溶酶處理的蛋白質提取率為95%;單一自溶酶處理效果優于超聲處理。該研究為克服酶的高成本,利用原位酶生產自溶酶,不但降低成本,而且專一性高。這為酶處理的選擇性提供了一條新思路。

在考慮酶處理成本問題上,除了利用原位酶生產具有高度專一性的酶外,還可以使用固定化酶,降低所需酶的量,并且減少下游過程成本。然而,影響酶處理微藻破碎效率的缺點之一是處理時間長,因此與機械或化學處理相比,生產能力較低。

3.2 溫和、輕度細胞破碎新技術

由于微藻經濟利用價值越來越顯著,綜合開發利用微藻胞內所有物質已成為趨勢。近幾十年來研究表明,現有的技術方法不足以滿足或不適宜全面開發利用微藻的需求;因此尋求與開發新溫和有效的微藻細胞破碎技術成為當前提取微藻生物活性物質的關鍵。目前已有一些新技術用于微藻細胞破碎,包括超臨界流體法、微流法、脈沖處理技術和陽離子聚合物涂層膜破碎細胞。

3.2.1 流體空化法 超臨界流體是指物質在高于臨界溫度和臨界壓力時形成的兼具氣液兩相性質的流體,因而具有良好的溶解特性以及擴散性。超臨界流體技術被廣泛地用于中藥和天然產物活性物質的萃取[58]。傳統的細胞破碎技術如高壓勻漿技術、球磨法、超聲處理等會在操作過程中產生大量能量或出現局部過熱現象,這對提取生物活性物質是不利的;酶法處理則不可避免地引入雜質,增加了分離的工作量,而導致成本增加。而超臨界流體細胞破碎技術則很好地避免了上述問題。超臨界流體常用的有CO2、N2等;超臨界流體破碎細胞是將高壓CO2滲透到細胞內,突然降壓使細胞內外壓差急劇增大而膨脹破裂;對于細胞壁較厚的微生物,因CO2能破壞胞壁上的脂溶性成分,破碎后的細胞碎片較大,便于下游分離;同時在降壓過程中流體體積膨脹、溫度降低,可防止因升溫引起生物活性物質失活。

Duarte等[59]用不同破碎技術提取酵母脂質的研究結果表明,超聲輔助CO2超臨界流體萃取酵母脂質的提取率為20%;但比Milanesio[60]單用超臨界流體萃取酵母得到脂質提取率為10%的高。超臨界流體細胞破碎技術與傳統技術如有機溶劑萃取、機械破碎等方法相比提取率雖小,但是與傳統技術手段相比還是存在一定的優勢,如何進一步探索出更有效的超臨界流體細胞破碎技術組合將是下一步研究的內容[61]。如Dierkes等[62]進行的一項實驗中,超臨界CO2流體能夠有效地破壞淋球菌,使細胞內容物的釋放。得到脂質和蝦青素的產率在分別在72.3%～92.6%和80%～100%之間。如此高效的破碎能力將使得超臨界流體作為適用于溫和的細胞破碎技術具有極大的潛能。

3.2.2 微流化處理法 微流化處理法用于破碎微藻細胞是最近興起的細胞破碎技術,微流化均質操作原理與高壓均質不同[45];在微流化器中,兩股細胞懸浮液高速撞擊在固定表面,沖擊時能量瞬間消散而導致細胞破裂;細胞破碎的率取決于初始細胞濃度、通過的次數和壓力。因破碎室區域溫度最高,細胞懸浮液在破碎室中停留只有25～40 s;將破碎細胞液浸入冰水浴中,可防止活性物質失活。

Cha等[63]用微流化處理小球藻提取葉黃素的研究結果顯示,微流化處理提高了小球藻在消化過程中葉黃素膠束化效率,經68.96 MPa微流化處理后,電鏡結果顯示,小球藻粒徑由3.56 μm下降到0.35 μm。經137.9 MPa微流化處理后,葉黃素膠束化效率提高三倍,且葉黃素穩定性不受微流化影響。結果顯示,微流化處理法能極其有效地破碎小球藻,有效地提高了葉黃素的提取率。Cha[64]等在模擬微流化對小球藻類胡蘿卜素的生物消化過程影響實驗證實了其前期試驗結果;在137.9 MPa微流化處理后微藻平均粒徑從2463 nm下降至361 nm;玉米黃素和類胡蘿卜素模擬消化率由原來未經處理的2.60%和1.69%分別提高到32.60%和18.19%。

這些結果均表明,微流化可有效地破碎小球藻細胞壁和提高玉米黃素和β-胡蘿卜素等生活性物質的提取率。如Xia N等[65]通過酶輔助微流化制備大米蛋白,蛋白回收率高達81.87%,主要為谷蛋白且具有天然結構;這些結果表明,酶輔助微流化可能是非破壞性和選擇性提取水稻谷蛋白的有效技術。這也為微流化處理微藻提取活性蛋白提供借鑒。

3.2.3 脈沖電場處理法 脈沖電場用于微藻細胞破碎的研究還在起步階段;脈沖電場(PEF)或高強度電場脈沖(HELP)使用外部電場引起細胞膜或壁上的電場強度達到一定閾值后,電場誘導的張力誘導膜或細胞壁形成電穿孔,細胞的通透性增加,使胞內物質更容易釋放出來[65]。電穿孔的大小和數量與電場強度和脈沖直接相關;且電穿孔的形成是不可逆的。PEF不僅破壞細胞壁,而且還影響細胞內的分子;如PEF處理過程溫度升高而影響酶的活性,導致蛋白質等高價值物質消化率降低,從而提高脂質和蛋白質等物質的產率[1]。

張若兵等[66]用高壓脈沖電場破碎小球藻的研究表明,高壓脈沖電場強度和脈沖注入能量密度是影響高壓脈沖電場處理效果的關鍵因素,而脈沖寬度、脈沖重復頻率、電場極性對小球藻的處理效果影響不大。這與Lam等[67]研究脈沖電場處理效果的關鍵參數分析具有類似性。張若兵等人測試電場強度從2.5 MV/m增加到5.0 MV/m時,小球藻細胞破碎率從17.21%增加至83.29%;同樣增加能量的輸入細胞破碎率也增大到80%以上,細胞內葉綠素的質量濃度明顯下降(未給定值),顯示出脈沖電場處理有良好的的效果。但Lam等人用脈沖電場處理小球藻獲取蛋白質的研究表明,即時輸入高能量(珠磨法的100倍[42]),蛋白質提取率只有13%,遠小于珠磨法的53%蛋白提取率,認為PEF處理微藻細胞無法釋放足夠量的蛋白質,而且PEF耗能大。Lam[68]等又進一步研究PEF微藻細胞破碎的處理能力,發現萊茵衣藻細胞壁突變體用PEF處理后水溶性蛋白質全部溶出,蛋白質最大提取率為37%,其效果與機械處理類似;而用PEF處理野生型萊茵衣藻蛋白提取率僅有11%左右。該實驗的微藻處理后的電鏡結果顯示突變體用PEF處理前后細胞基本保持完整性;這證明PEF是一種較溫和的細胞破碎技術;但是用PEF處理的提取率偏低,還有待于進一步研究,如結合酶處理先破碎細胞壁再進行PEF處理,或許能達到更好的提取效果。。

3.2.4 陽離子聚合物涂膜法 目前已有提出用陽離子聚合物破碎微藻細胞[1]，如Yoo等[69]首先使用用陽離子聚合物的功能膜設計出一種新穎、輕度且高效的細胞破碎技術,從濕微藻中直接提取細胞內脂質。使用涂有帶正電荷的叔胺聚合物的膜,來誘導具有兩性的微藻細胞膜局部靜電平衡與帶負電荷的磷脂雙層的擾動,透鏡顯示微藻的磷脂雙分子層局部重排而引起的細胞破裂,微藻破碎率在25%左右。Zhengyi等[70]用熱聚合物如聚-(N-異丙基丙烯酰胺-共-烯丙胺)和酶與微藻細胞懸浮液混合,細胞破碎率從22%增加至68%;脂質產率達到了59%。該研究還發現該聚合物可以協助酶破碎細胞壁或者能對酶起到保護作用,證實這種簡單的先進技術能有效地促進了微藻細胞壁內含物的釋放。

使用熱聚合物的優點是在產品回收后,聚合物能進行簡單有效的分離,還可重新使用,從而降低總成本。以上研究表明聚合物破碎微藻細胞壁提取蛋白將是一個很有前景的技術。

3.3 各種細胞破碎技術的優點與局限性

表3歸納了目前采用的各種微藻細胞破碎方法的優點和局限性,各技術方法的比較詳見表3。

表3 各種細胞破碎技術之間的比較Table 3 Comparison of various cell disruption techniques

4 展望

微藻生物煉制的關鍵瓶頸是微藻細胞破碎,如何低成本、大規模、高效地提取微藻胞內活性物質(如蛋白質等)將是未來研究的關鍵。現有研究表明,細胞破碎技術之間的組合能有效提高蛋白質產率,如何將具有高細胞破碎率潛力的聚合物涂抹法和其他傳統技術組合以提高細胞破碎率、蛋白質產率和降低成本,將是未來微藻細胞破碎的發展方向。未來的微藻細胞破碎應當基于目標產物特性,從細胞破壁原理出發采用組合破壁技術進行破壁提取活性蛋白;如珠磨法和酶法聯合使用,先通過適度機械力破除酶作用位點障礙,在進行酶解提取,從而提高蛋白的產量和品質等。降低成本可從上游技術著眼:有研究顯示用PEF處理萊茵衣藻細胞壁的突變體導致更高的脂質和蛋白質提取率;因此通過PEF誘導培養微藻細胞壁突變體,增大高附加值物質產量的同時減少能耗。在微藻培養過程中,通過控制微藻和細菌協同培養的相互作用,細菌能有效地提高微藻蛋白等高附加值活性物質的產率[71],其效果比在微藻培養過程中增設生物反應器還要顯著;微藻與細菌的共生培養將是提高微藻生物產出的新方向。

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