響應面法優化鵝全骨硫酸軟骨素的酶法提取工藝

謝 晶，尹義捐，楊欲成，金晨鐘,*，王雙輝，盧 超

（1.湖南人文科技學院農業與生物技術學院，湖南 婁底 417000；2. 湖南人文科技學院，湖南省農田雜草防控技術與應用協同創新中心，湖南 婁底 417000）

我國的畜骨和禽骨資源極為豐富，但是由于技術水平的限制，對這一優質營養資源的利用卻很落后。我國對畜禽骨的深加工利用率不足1%，造成許多畜禽骨的極度浪費，一般只能將其丟棄或是加工成商品附加值不高的產品，如簡單的骨粉、骨泥、飼料和食品調味料等[1-2]。鵝骨是一種營養價值非常高的畜禽屠宰加工副產品，在動物體中約占25%，骨骼中90%的蛋白為膠原、骨膠原及軟骨素等。但鵝骨在我國畜禽骨開發利用中所占比例較小，隨著我國對硫酸軟骨素的需求不斷增大，從鵝骨中提取硫酸軟骨素的研究有著重要意義[3-4]。

硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）是具有硫酸基、羧基和乙酰基的一類糖胺聚糖[5-6]，廣泛存在于動物軟骨、骨、肌腱、肌膜和血管壁中[7]，具有增加骨密度[8]、促進神經細胞分裂與發育[9]、消炎[10]等功能。CS具有降血脂、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、提高免疫力等多種藥理活性，能夠防止動物和人體的動脈硬化，且能防治冠狀動脈心臟病的發作[11-12]。在國外，用鯊魚硫酸軟骨素來治療和預防癌癥及疑難癥，效果明顯。隨著對CS生理功能及其生化性質的深入研究，在國外CS已成為流行的保健品添加劑，也常作為膳食補充劑用于保護關節[13-15]。目前有不少工廠生產CS，但大多采用濃堿法、稀堿法、中性鹽法等傳統工藝，精制工藝往往要經過除雜、脫色等過程，工藝控制繁瑣，因而質量不穩定、收率降低，而且堿、鹽易對環境造成污染[16-19]。

本研究以麻陽鵝鵝全骨為原料，采取堿提-酶解-醇沉的方法制備CS，重點對酶解這一直接影響CS提取率的關鍵步驟進行優化研究，以提取率為評價指標，在單因素試驗的基礎上優化工藝，通過響應面優化分析法最終確定最佳工藝參數。本研究擬通過對鵝全骨CS的提取工藝研究，提高其應用發展前景和經濟價值，為其進一步研究和綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鵝全骨由湖南省懷化市麻陽縣懷化苗家王食品有限公司提供。

木瓜蛋白酶（≥800 000 U/g） 上海瑞永生物科技有限公司；胃蛋白酶（≥12 000 U/g）、胰蛋白酶（≥50 000 U/g） 國藥集團化學試劑有限公司；硫酸軟骨素A（chondroitin sulfate A，CSA）標準品（純度≥98.0%）、鹽酸氨基葡萄糖標準品（純度≥99.0%） 上海源葉生物科技有限公司；所有分離用有機溶劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

KQ-250DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TG20KR-D高速冷凍離心機 長沙東旺實驗儀器有限公司；Waters E2695高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 CS的制備工藝流程

鵝骨高溫蒸煮→清洗→干燥→粉碎→堿提→過濾→濾液調pH值→加胰蛋白酶酶解→酶滅活→調pH值→加蛋白酶→酶滅活→過濾→濾液加入高嶺土、活性炭脫色→抽濾→調節pH值，加入NaCl→醇沉→離心→乙醇洗滌脫水→干燥→粗成品

1.3.2 CS的制備工藝操作要點

1.3.2.1 高溫蒸煮與堿解

將鵝骨投入恒溫蒸煮鍋于90 ℃煮2～4 h，而后放入電熱恒溫鼓風干燥箱烘烤6～8 h后立即絞碎；稱取5 g鵝骨粉，按照原料與質量分數5% NaOH的比例為1∶6.25（m/V）加入NaOH溶液，室溫浸提12 h；然后用超聲波輔助提取3 h，再用2 mol/L HCl調pH值至6.0～6.8，雙層紗布過濾；留下濾液，濾渣再以1∶0.5（m/V）的比例加入質量分數5% NaOH，再用超聲波輔助提取1 h，雙層濾布過濾；棄濾渣，取濾液，合并2 次濾液，并測量體積，待用。

1.3.2.2 酶解

濾液用2 mol/L HCl調節pH值至8.0～9.0，按照濾液與胰蛋白酶1 000∶1.5（V/m）的比例加入胰蛋白酶，于40～50 ℃水解2 h后，于90 ℃恒溫水浴20 min滅活；調節水解液pH值至2.0～4.0，再按1 000∶1.5（V/m）的比例加入胃蛋白酶，40～50 ℃水解4 h；水解完畢后用4 層紗布過濾，并加入高嶺土和活性炭（使其終質量分數均為0.5%）進行吸附，同時慢速間歇攪拌4 h或快速升溫至90 ℃后間歇攪拌30 min，冷卻后抽濾。

1.3.2.3 沉淀

將1.3.2.2節所得濾液調節pH值至6.8～7.2，加入NaCl使其質量分數為3%，再加入2.5 倍體積的體積分數95%乙醇沉淀；待澄清后，棄清液，用體積分數95%的乙醇洗滌沉淀3～4 次，6 000 r/min條件下離心10～15 min，收集沉淀，沉淀物即為CS粗成品。

1.3.2.4 干燥

將上述沉淀物放入電熱恒溫鼓風干燥箱，于60～80 ℃直接烘干即得粗成品。

1.3.3 實驗設計

1.3.3.1 蛋白酶種類的選擇

全骨原料表面有很多殘存的肌肉和其他結締組織，還有一層堅韌的軟骨膜，它們的存在會影響CS的提取率和純度。由于全骨中的雜質主要成分為蛋白質，因此選擇蛋白酶對全骨進行酶解。

在文獻[20-23]的基礎上，以蛋白質去除率和CS提取率為指標，篩選最佳酶解蛋白酶。為進一步了解不同種酶對鵝全骨中CS提取率的影響，對木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶在各自的最佳水解條件下進行實驗，對比它們對蛋白質的去除效果和CS提取率。

1.3.3.2 胃蛋白酶酶解條件單因素試驗設計

以提取率為指標，對胃蛋白酶的酶解條件進行優

表1 響應面設計因素編碼及水平Table 1 Codes and levels of independent variables used in response surface methodology

1.3.4 指標測定

1.3.4.1 蛋白質去除率

蛋白質去除率按照公式（1）計算。化，對胃蛋白酶加酶量、酶解時間、酶解溫度和pH值4 個因素進行單因素試驗[24]。

將胰蛋白酶處理后的酶解液用胃蛋白酶處理，酶解時間為6 h，酶解溫度為45 ℃，pH值為3.0，胃蛋白酶加酶量分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/L時，考察胃蛋白酶加酶量對CS提取率的影響。

將胰蛋白酶處理后的酶解液用胃蛋白酶處理，酶解時間分別為2、4、6、8、10 h，酶解溫度為45 ℃，pH值為3.0，胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L時，考察酶解時間對CS提取率的影響。

將胰蛋白酶處理后的酶解液用胃蛋白酶處理，酶解時間為6 h，酶解溫度分別為35、40、45、50、55 ℃，pH值為3.0，胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L時，考察酶解溫度對CS提取率的影響。

將胰蛋白酶處理后的酶解液用胃蛋白酶處理，酶解時間為6 h，酶解溫度為45 ℃，pH值分別為2.0、2.5、3.0、3.5、4.0，胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L時，考察酶解pH值對CS提取率的影響。

1.3.3.3 響應面優化試驗設計

利用響應面法對酶解過程中影響CS提取率的因素及因素間的交互影響進行優化[25-26]，即根據Box-Benhnken試驗設計原理，結合單因素試驗結果，選取胃蛋白酶加酶量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）和pH值（D），進行4因素3水平試驗，利用響應面法分析影響胃蛋白酶水解的主次因素，得出該階段的最佳工藝條件。響應面設計因素編碼及水平如表1所示。

1.3.4.2 總氮含量

酶解液中總氮含量、酶解前堿提液中總氮含量的測定：采用凱氏定氮法[27]。

1.3.4.3 CS提取率

CS提取率按照公式（2）計算。

式中：m為提取所得CS粗品的質量/g；m0為鵝骨原料質量/g。

1.3.4.4 定性及定量分析

稱取25.0 mg經105 ℃干燥4 h的CS標準品和25.0 mg鹽酸氨基葡萄糖或樣品于燒杯中，加入5.0 mL乙腈，振蕩使其分散均勻，再加入水，用超聲波使其溶解；轉移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度，搖勻，CS質量濃度約為0.5 mg/mL，鹽酸氨基葡萄糖質量濃度約為0.5 mg/mL，樣品溶液濃度未知。用Waters E2695高效液相色譜儀（流動相：乙腈-戊烷磺酸鈉溶液（體積比10∶90），C18色譜柱，流速0.8 mL/min、檢測波長192 nm）分別對標準溶液、樣品溶液進行測定，記錄色譜圖，并對樣品的色譜圖與標準品的色譜圖進行對照[28]。

1.4 數據處理

數據采用平均值±標準差表示，用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行方差分析和差異顯著性比較。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶種類的選擇結果

表2 不同蛋白酶處理時的蛋白質去除率和CS提取率Table 2 Comparison of protein removal and CS extraction with different proteases

由表2可知，3 種酶的蛋白質去除率和CS提取率有明顯不同，其中以胃蛋白酶的應用效果最好，從蛋白質去除率和CS提取率來看，胃蛋白酶的綜合效果最佳。

2.2 胃蛋白酶酶解提取CS的單因素試驗結果

2.2.1 胃蛋白酶加酶量對CS提取率的影響

圖1 胃蛋白酶加酶量對CS提取率的影響Fig. 1 Effect of pepsin dosage on extraction yield of CS

由圖1可知，在胰蛋白酶加酶量為1.5 g/L，胃蛋白酶加酶量為0.5～1.5 g/L時，CS提取率明顯上升，當胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L左右時達到極值，之后變化不大。這可能是由于鵝骨中的蛋白質在胰蛋白酶、胃蛋白酶加酶量均為1.5 g/L時水解基本完全，因此胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L左右為最佳。

2.2.2 胃蛋白酶酶解時間對CS提取率的影響

圖2 胃蛋白酶酶解時間對CS提取率的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time on extraction yield of CS

由圖2可知，隨著胃蛋白酶酶解時間的增加，CS提取率逐漸增大，而在酶解4 h后CS提取率基本沒有變化，因此酶解時間4 h為最佳。

圖3 胃蛋白酶酶解溫度對CS提取率的影響Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on extraction yield of CS

2.2.3 胃蛋白酶酶解溫度對CS提取率的影響由圖3可知，CS提取率隨胃蛋白酶酶解溫度的升高呈上升趨勢，但溫度超過45 ℃時開始下降。由此可見，酶解溫度過高或過低均會影響CS的提取率，這是由于胃蛋白酶在不同溫度條件下的酶解程度不一樣[29]。溫度過低時，溶液中分子擴散運動慢，酶沒有充分發揮作用；而溫度過高時，會對酶產生鈍化效用，因此提取鵝全骨中的CS時，酶解溫度為45 ℃最佳。

2.2.4 胃蛋白酶酶解pH值對CS提取率的影響

圖4 胃蛋白酶酶解pH值對CS提取率的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis pH value on extraction yield of CS

由圖4可知，胃蛋白酶酶解pH值對CS提取率的影響較大，這是由于pH值的變化會影響溶液中電荷的分布，直接影響到酶解的效果，因此在酶解過程中應盡量保持pH值的穩定[30]。對鵝全骨中CS的提取來說，酶解pH值為3.0時，其提取率最高。

2.3 響應面法優化試驗結果與分析

2.3.1 響應面試驗結果及其方差分析

在單因素試驗基礎上，進行4因素3水平的響應面分析，確定酶解的最佳條件，試驗方案與結果如表3所示。

表3 Box-Benhnken試驗設計及結果Table 3 Box-Benhnken design and experimental results

將獲得的試驗數據采用Design-Expert 8.0.6.1軟件進行多元回歸擬合，得到胃蛋白酶加酶量（A）、酶解時間（B）、酶解溫度（C）和pH值（D）對CS提取率的二次多項式回歸模型方程：CS提取率=11.97＋1.18A＋0.77B－0.98C－0.31D＋0.65AB＋0.06AC＋0.83AD－1.18BC－0.41BD＋0.29CD－2.23A2－1.45B2－2.09C2－3.35D2。

對該回歸模型進行方差分析，并對模型系數進行顯著性檢驗。由表4可知：模型P＜0.01，表明響應回歸模型達到了極顯著水平；失擬項P=0.065 2＞0.05，不顯著；模型一次項A、C極顯著，二次項A2、B2、C2、D2極顯著，一次項B、交互項AD、BC顯著，其余不顯著；校正決定系數R2Adj為0.858 2，變異系數為10.97%，大于4%，表明該模型有適當的信號響應；預測復相關系數=0.732 6，和校正相關系數=0.858 2基本符合。上述數據表明，得到的模型與試驗數據擬合較好，可直接利用該模型得到胃蛋白酶提取鵝全骨中CS的最佳工藝。

表4 模型的方差分析及顯著性檢驗Table 4 Analysis of variance and signifi cance test of regression model

2.3.2 各因素的交互作用分析

響應面的三維圖反映出各試驗因素的交互作用對響應值的影響并非單一的線性關系，可根據其曲面的不同來判斷各試驗因素交互作用的強弱。曲面越陡峭，表示因素對響應值的影響越顯著；曲面越平整，表示因素對響應值的影響越不顯著。通過響應面三維圖對胃蛋白酶加酶量（A）和pH值（D）及其交互作用、酶解溫度（C）和pH值（D）及其交互作用進行分析與評價，并確定最佳工藝水平范圍。

圖5 胃蛋白酶加酶量和pH值對CS提取率交互作用的響應曲面圖Fig. 5 Response surface plot showing the interactive effect of pepsin dosage and hydrolysis pH value on extraction yield of CS

由圖5可知，在酶解時間為6 h、酶解溫度為45 ℃時，當胃蛋白酶酶解pH值較低時，CS提取率隨pH值的增大而升高，但當pH值超過3時，CS提取率隨pH值的增大而降低。綜合分析，在試驗正常水平范圍內，胃蛋白酶加酶量和pH值分別在1.5～2.0 g/L和2.50～3.50范圍內時，CS提取率可以達到最大值。

圖6 胃蛋白酶酶解溫度和pH值對CS提取率交互作用的響應曲面圖Fig. 6 Response surface showing the interactive effect of hydrolysis temperature and pH value on extraction yield of CS

由圖6可知，在胃蛋白酶加酶量為1.5 g/L、酶解時間為6 h時，當酶解溫度較低時，CS的提取率隨溫度的升高而增大，但當酶解溫度超過45 ℃時，CS提取率隨著酶解溫度的升高而降低。綜合分析，在試驗正常水平范圍內，酶解溫度和pH值分別在40～45 ℃和2.50～3.50范圍內時，CS提取率可以達到最大值。

2.3.3 最佳胃蛋白酶酶解提取工藝驗證實驗

通過模型預測出胃蛋白酶酶解提取CS的最佳工藝為加酶量1.55 g/L、酶解時間6.42 h、酶解溫度42.14 ℃、pH值3.09，CS提取率的預測值為12.14%。為了操作方便，把驗證實驗的提取工藝調整為胃蛋白酶加酶量1.55 g/L、酶解時間6.4 h、酶解溫度42 ℃、pH值3.00，進行3 組平行實驗，取平均值，得到的實際CS提取率為12.35%，與所預測的最優值無明顯差異。

2.4 CS的定性

圖7 CS標準溶液的高效液相色譜圖Fig. 7 HPLC chromatogram of CS standard solution

由圖7～8可知，CS標準品和樣品中的CS在高效液相色譜圖中的出峰時間基本一致。在Waters E2695高效液相色譜儀分析軟件上進行光譜匹配，匹配度達998.992，可確定提取物為CS。

圖8 樣品中CS的高效液相色譜圖Fig. 8 HPLC chromatogram of CS prepared in this study

3 結 論

以鵝全骨為原料提取CS，在堿提的基礎上，采用胰蛋白酶與胃蛋白酶進行分步酶解，并對胃蛋白酶酶解的提取工藝進行優化，得到胃蛋白酶酶解的最佳工藝為加酶量1.55 g/L、酶解時間6.42 h、酶解溫度42.14 ℃、pH值3.09，提取率的預測值為12.14%。

對根據響應面優化試驗得出的最佳提取工藝進行實驗驗證，鵝全骨中CS提取率為12%左右。本研究以鵝全骨為原料提取CS的新提取工藝，能更好地利用鵝加工的副產品——鵝全骨，提高資源的合理利用率，為現有CS生產企業提供了改進的生產工藝，為提高產品質量和經濟效益及下一步CS的提純提供了參考。