低氧預(yù)適應(yīng)期TrkB-FL在HT22神經(jīng)細(xì)胞中的表達(dá)變化研究

吳曉東，白春英

低氧/缺血（Hypoxia/ischemia，H/I）目前臨床上常見的病癥，是航天、深水、高原等極端環(huán)境中面臨的重要難題[1-2]，也是基礎(chǔ)科研有待攻克的研究領(lǐng)域.而低氧預(yù)適應(yīng)（Hypoxic preconditioning，HPC）是機(jī)體抵抗H/I的一種由多因素、多信號(hào)共同參與和相互作用的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[3]，但是詳細(xì)機(jī)制還尚未明確.全長(zhǎng)型酪氨酸激酶受體B（TrkB-FL）是腦衍化的向神經(jīng)因子特異性受體，其具有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域，常在機(jī)體壓力下產(chǎn)生[4].TrkB-FL受體與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子結(jié)合后，能夠使靶點(diǎn)細(xì)胞區(qū)域內(nèi)TrkB受體上的酪氨酸殘基部位自身磷酸化程度加強(qiáng)，繼而激活下游一系列的連鎖反應(yīng)，這些改變對(duì)大腦的正常發(fā)育、突觸可塑性、遷移和定位、神經(jīng)元板層結(jié)構(gòu)的形成方面發(fā)揮重要的作用[5-6].

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究使用的是小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞系HT22細(xì)胞株.

1.2 儀器與試劑

細(xì)胞培養(yǎng)箱（FORMA，Thermo）；超凈臺(tái)（1300SERIES，Thermo）；顯微鏡（DSZ2000，Thermo）；培養(yǎng)皿；CO2 孵育箱；非接觸式超聲儀（Bioruptor UCD-300，北京德泉興業(yè)公司）；酶標(biāo)儀（MULJZSKAN FC）；蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜設(shè)備（Trans-Blot）；化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)（fusion pulse 6，北京五洲東方科技）；小型臺(tái)式冷凍離心機(jī)（5424R，Thermo）.PBS緩沖液；蛋白酶抑制劑；丙烯酰胺凝膠；Tris.Hcl液；胎牛血清；新生牛血清；青鏈霉素；DMEM培養(yǎng)基；胰酶；鼠源一抗體及HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗體（生工生物公司）；顯影發(fā)光液（北京普利賴基因公司）.

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞密度將要達(dá)到90%且細(xì)胞狀態(tài)較好時(shí)，可進(jìn)行傳代，即棄掉舊培養(yǎng)基，加入2ml的PBS液，輕搖并清洗細(xì)胞.共洗兩次；洗最后一次時(shí)，加1ml胰酶于培養(yǎng)皿中，片刻后棄掉胰酶；把培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱內(nèi)，進(jìn)行消化；片刻后，取出培養(yǎng)皿，加入3ml的完全培養(yǎng)基，慢慢地吹打細(xì)胞，將細(xì)胞吹打均勻；最后把混勻好的細(xì)胞懸液分裝到若干的培養(yǎng)皿中（一般取細(xì)胞吸打液加6ml培養(yǎng)基）；放置在培養(yǎng)箱中進(jìn)行低氧處理.

1.3.2 細(xì)胞低氧模型的構(gòu)建

當(dāng)細(xì)胞的密度度達(dá)到70%左右時(shí)，慢慢的棄掉舊的培養(yǎng)基，并補(bǔ)加3ml的新培養(yǎng)基；當(dāng)細(xì)胞孵育7～8個(gè)小時(shí)后，立刻進(jìn)行低氧處理.本實(shí)驗(yàn)的低氧預(yù)適應(yīng)處理組的方法為：低氧20min、常氧20min、低氧20min、常氧20min、低氧20min、常氧 20min、低氧 20min、常氧 20min，循環(huán)次數(shù)為 5次，實(shí)驗(yàn)條件為是99%的即為低氧；低氧預(yù)適應(yīng)處理完畢后，立即把低氧預(yù)適應(yīng)組以及低氧組的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞均放入CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行低氧處理；低氧預(yù)適、低氧、常氧完畢后，將細(xì)胞進(jìn)行提取，用于后續(xù)蛋白檢測(cè)實(shí)驗(yàn).

1.3.3 Western bolt

蛋白提取，將取收集好的細(xì)胞，放入高壓過的1.5mL EP管中，加入300μL細(xì)胞裂解液和1%蛋白酶抑制劑；50赫茲，50%的工作/間歇超聲破碎細(xì)胞，每換一管細(xì)胞都洗凈探頭；4℃ 15000g 離心15min；離心后繼續(xù)超聲破碎；4℃15000g離心25min；取上清液放入新1.5mLEP管中，-80℃保存.

蛋白濃度測(cè)定，設(shè)計(jì)A-I標(biāo)準(zhǔn)液孔、待樣品孔、空白對(duì)照孔，均做兩個(gè)復(fù)孔；取96孔板，在孔板中分別加入100μL工作液和5μL蛋白稀釋液、100μL工作液和5μL蛋白標(biāo)準(zhǔn)液；

蓋上板蓋，放入搖床中搖30min；放入酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度，計(jì)算樣品濃度（C終）.

蛋白混合液配制，將測(cè)得的蛋白進(jìn)行定量，見表1.V（蛋白所需體積）=m/C終，V1（抗氧化劑體積）=V/10，V2（Loading buffer體積）=（V1+V2）/3，V3上樣體積 =V+V1+V2；點(diǎn)樣或-20℃保存.

表1 蛋白混合液的配制

電泳，制備5%的濃縮膠和6%的分離膠，濃縮膠恒壓105V、分離膠恒壓65V，10μg蛋白質(zhì)加樣量；轉(zhuǎn)膜，恒流400mA、電壓80V 4小時(shí)；閉，用5%脫脂奶粉封2小時(shí)，用洗膜液洗3次；孵育一抗4℃搖床過夜（1；100）、再孵育二抗室溫?fù)u床2小時(shí).

顯影和曝片，用等體積的顯影A液、B液混合液浸泡膜并曝片.

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件，運(yùn)用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法為方差分析（ANOVA）和T-Test檢驗(yàn)，比較了低氧不同天數(shù)組與細(xì)胞低氧次數(shù)之間的差異，即實(shí)驗(yàn)中P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 低氧預(yù)適應(yīng)后能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生耐受作用

圖1 細(xì)胞低氧后鏡下觀察結(jié)果（鏡下，×200）

由圖1所示，空白對(duì)照（圖1A）的細(xì)胞狀態(tài)良好.低氧組（圖1B）細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生變化，有大量的小圓泡，可能是固縮的細(xì)胞，折光率增強(qiáng).低氧預(yù)適應(yīng)組（圖1C）圓泡數(shù)量介于對(duì)照與低氧組之間，大部分細(xì)胞形態(tài)完好，核質(zhì)清晰可見，說明低氧模型和低氧預(yù)適應(yīng)模型構(gòu)建成功.

2.2 蛋白濃度和純度的測(cè)定

如圖2所示，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得公式y(tǒng)=ax+bK=c（K越接近1越好），蛋白濃度R2(R平方值)在0.9～1之間，表明蛋白濃度較純，可用于本實(shí)驗(yàn).

圖2 蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 低氧預(yù)適應(yīng)HT22細(xì)胞中TrkB-FL的表達(dá)上調(diào)

如圖3所示，與對(duì)照組相比，急性低氧（0d）組HT22細(xì)胞中TrkB-FL蛋白表達(dá)有降低的趨勢(shì)，而低氧預(yù)適應(yīng)（4d）組HT22細(xì)胞中TrkB-FL蛋白表達(dá)有增加的趨勢(shì)；低氧預(yù)適應(yīng)組較低氧損傷組，其TrkB-FL蛋白表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05）.因此，TrkB-FL 可能在低氧預(yù)適應(yīng)中通過表達(dá)上調(diào)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用.

圖3 TrkB-FL的Western blot結(jié)果

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)低氧預(yù)適應(yīng)是機(jī)體在非致死性缺氧狀態(tài)下產(chǎn)生的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制[7].低氧預(yù)適應(yīng)可能是通過上調(diào)保護(hù)性因子表達(dá)或下調(diào)損傷性因子表達(dá)，從而達(dá)到內(nèi)源性保護(hù)作用.如在神經(jīng)系統(tǒng)，低氧預(yù)適應(yīng)可通過下調(diào)HESC、NR2B等因子產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)[8-9]，HPC通過高表達(dá)PKC、CaveOLI-3、Caspase-3、Bcl-2 等因子產(chǎn)生保護(hù)作用[10-11].但是目前分子機(jī)制仍未明確.而我們通過構(gòu)建低氧和低氧預(yù)適應(yīng)細(xì)胞模型，也是為了探索其中發(fā)揮作用的保護(hù)性因子及相關(guān)機(jī)制，以上實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了細(xì)胞低氧耐受隨著低氧次數(shù)的增加有上升的趨勢(shì)，表明模型構(gòu)建成功，一些因子表達(dá)可能發(fā)生變化，從而增加機(jī)體低氧耐受.

研究表明，當(dāng)機(jī)體處于H/I時(shí)TrkB-FL受體及其配體表達(dá)會(huì)發(fā)生改變[12]，不同程度的低氧都可以通過調(diào)控TrkB-FL的表達(dá)來影響腦部的生理功能，這種調(diào)控主要分為兩個(gè)方面.當(dāng)機(jī)體急性缺氧時(shí)，TrkB-FL在調(diào)控和維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)生存和修復(fù)的方面起著很重要的作用[11].前人在急性缺氧對(duì)TrkB-FL表達(dá)影響的研究中發(fā)現(xiàn)急性低氧刺激是通過調(diào)控BDNF和TrkB-FL在神經(jīng)元中的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，這表明二者在神經(jīng)系統(tǒng)中起著重要調(diào)節(jié)作用[13-14].此外，研究發(fā)現(xiàn)將神經(jīng)細(xì)胞分別放入急性低氧和常氧環(huán)境下培養(yǎng)，BDNF及TrkB-FL受體在急性低氧狀態(tài)下的結(jié)合明顯下降[15]，本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了急性低氧（0d）組HT22細(xì)胞中TrkB-FL蛋白表達(dá)降低，由此可見急性低氧對(duì)TrkB-FL調(diào)節(jié)具有負(fù)性作用.小鼠經(jīng)多次低氧后，即低氧預(yù)適應(yīng)，TrkB通過與配體BDNF結(jié)合對(duì)神經(jīng)元損傷的修復(fù)和存活發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用[16].本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了低氧預(yù)適應(yīng)（4d）組HT22細(xì)胞中TrkB-FL蛋白表達(dá)增加，因此TrkB-FL可能在低氧預(yù)適應(yīng)中通過表達(dá)上調(diào)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用.除此之外，低氧預(yù)適應(yīng)組與低氧損傷組相比，其TrkB-FL蛋白表達(dá)明顯升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P＜0.05），由此可見，低氧預(yù)適應(yīng)時(shí)TrkB-FL在神經(jīng)元的損傷修復(fù)中起到重要作用.