當歸對血虛便秘模型小鼠結腸水通道蛋白8表達的影響

杜麗東 雒軍 吳國泰 牛亭惠 李越峰 袁菊麗 任遠

摘要：目的 觀察當歸對血虛便秘模型小鼠結腸水通道蛋白8（AQP8）的表達及AC-cAMP-PKA信號通路各因子含量的影響，探討當歸潤腸通便作用機制。方法 60只KM小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性藥組和當歸高、中、低劑量組，每組10只。采用復方地芬諾酯、乙酰苯肼及環磷酰胺聯合復制血虛便秘小鼠模型，實驗第14日起，當歸高、中、低劑量組分別給予16.7、8.8、4.2 g原藥材/kg當歸水煎液灌胃，陽性藥組給予5.0 g/kg常通舒顆粒藥液灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，觀察小鼠血虛便秘證候、排便時間，免疫組化、Western blot和qRT-PCR檢測小鼠結腸AQP8蛋白和mRNA的表達，ELISA檢測小鼠結腸AC-cAMP-PKA信號通路中各因子的表達。結果 模型組小鼠出現血虛便秘證候，糞便排出時間較正常組明顯延長（P<0.01），結腸AQP8蛋白和mRNA表達及腺苷酸環化酶（AC）、環磷酸腺苷（cAMP）、蛋白激酶A（PKA）含量顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，當歸各劑量組小鼠糞便排出時間明顯縮短，結腸AQP8蛋白和mRNA表達及AC、cAMP、PKA含量顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結論 當歸治療血虛便秘可能與調節結腸AC-cAMP-PKA信號通路，下調結腸AQP8蛋白和mRNA的表達有關。

關鍵詞：當歸；血虛便秘；水通道蛋白8；AC-cAMP-PKA；小鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.011

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0044-05

Abstract： Objective To observe the effects of Angelica Sinensis Radix on the expression of aquaporin 8 （AQP8） and the levels of AC-cAMP-PKA in colon of blood-deficiency constipation in mice； To identify mechanism of Angelica Sinensis Radix for loosening the bowels to relieve constipation. Methods Sixty Kunming mice were randomly divided into control group， model group， positive medicine group， and Angelica Sinensis Radix high-， medium-， and low-dose groups， with ten mice in each group. Diphenoxylate， acetylphenlyhydrazine and cyclophosphamide were used to establish blood-deficiency constipation mice models. From the 14th day of the experiment， Angelica Sinensis Radix high-， medium-， and low-dose groups were given 16.7， 8.8， and 4.2 g/kg Angelica Sinensis Radix Decoction for gavage. Positive medicine group was given 5.0 g/kg Changtongshu Granules Liquid for gavage. Control group and model group were given equal volume of saline for gavage. The symptoms of blood deficiency constipation were observed and defecation time. Immunohistochemistry， Western blot and qRT-PCR were used to detect the expression of AQP8 protein and mRNA in colon， and the expression of AC-cAMP-PKA in colon was detected by ELISA. Results The mice in the model group developed blood deficiency constipation syndrome； the defecation time was significantly prolonged （P<0.01）； the expression level of colonic AQP8 protein and mRNA， AC， cAMP and PKA significantly increased （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， the defecation time was significantly shortened in Angelica Sinensis Radix high-， medium-， and low-dose groups； the expression of AQP8 protein and mRNA and the levels of AC， cAMP and PKA were significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion The treatment of Angelica Sinensis Radix for blood-deficiency constipation may be related to adjusting the AC-cAMP-PKA signaling pathways and reducing the expression of AQP8 protein and mRNA.

Keywords： Angelica Sinensis Radix； blood-deficiency constipation； aquaporin 8； AC-cAMP-PKA； mice

當歸是傘形科植物當歸Angelicae sinensis （Oliv.）Diels的干燥根，具有補血活血、調經止痛、潤腸通便的功效。古醫籍記載以當歸配伍治療血虛便秘，如《沈氏尊生書》“潤腸丸”，《脾胃論》“導滯通幽湯”；當代名中醫亦喜用當歸配伍治療血虛便秘，如李國峰自擬養血潤腸方[1]，張東岳的“秘寶康”[2]等。以上方劑均以當歸組方治療血虛便秘療效較好，但當歸潤腸通便的藥理機制尚不十分明確。有研究表明，結腸黏膜水通道蛋白（AQP）8在糞便的水分吸收、黏液的分泌中發揮重要作用[3]。有研究表明，AQPs C末端磷酸化對其活性有調節作用，文獻證實AC-cAMP-PKA途徑參與了AQPs的表達調控[4]。本研究采用復方地芬諾酯、乙酰苯肼及環磷酰胺復制血虛便秘小鼠模型，觀察當歸對血虛便秘模型小鼠結腸AQP8的表達及AC-cAMP-PKA信號通路各因子含量的影響，探討當歸潤腸通便作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級KM小鼠60只，6～8周齡，體質量18～22 g，雌雄各半，甘肅中醫藥大學科研實驗動物中心，動物許可證號SCXK（甘）2015-0002。飼養于甘肅中醫藥大學SPF級動物實驗中心，室溫22～26 ℃，相對濕度60%，自然晝夜光線，適應性飼養3 d。

1.2 藥物及制備

當歸，蘭州復興厚藥材有限公司，批號160502，經甘肅中醫藥大學劉峰林副教授鑒定為正品。稱取當歸飲片，加8倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，過濾，藥渣加6倍量水煎煮1 h，合并2次濾液，過濾，濃縮至1.7 g原藥材/mL，消毒后分瓶、壓蓋包裝，冰箱保存備用。復方地芬諾酯片，常州康普藥業有限公司，批號160502；乙酰苯肼，上海源葉生物科技有限公司，批號20150701258；環磷酰胺，江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號14081021；常通舒顆粒，貴州威門藥業股份有限公司，批號160101。

1.3 主要試劑與儀器

GAPDH抗體，美國ImmunoWay公司，批號B4501；SP檢測試劑盒、DBA顯色試劑盒，北京中杉金橋生物科技有限公司，批號16183A09、K162418A；Trizol Reagent，美國Invitrogen公司，批號108303；Nuclease-Free water，上海前塵生物科技有限公司，批號0000124196；Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司，批號04102；GoTaq? qPCR Master Mix，普洛麥格（北京）生物技術有限公司，批號0000161385；R0010 RIPA組織裂解液、PMSF、10×麗春紅染色液、BCA蛋白測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、4×蛋白上樣緩沖液、甘氨酸、SDS、Tris，北京索萊寶科技有限公司，批號分別為20161111、20161108、20161027、20161104、20161024、20161115、1203P0614、1207G033、2016S075；山羊抗兔二抗，美國ImmunoWay公司，批號B0101。Benchmark? Plus酶標儀，美國Bio-Rad公司；BX51-32H01型顯微鏡，日本Olympus公司；低溫高速離心機，美國Biofage fresc公司；vortexer振蕩渦旋混合器，德國IKA公司；1008E型掌上離心機，大龍興創實驗儀器（北京）有限公司；SMA2000Thermo超微量分光光度計，Thermo Fisher Scientific；Bio-rad iCycleriQ熒光定量PCR儀，美國伯樂公司；ELITE300穩壓穩流電泳儀，美國Wealtec公司；AzureC300曝光儀，美國Azure Biosystems公司。

1.4 分組及造模

實驗小鼠按性別、體質量隨機分為正常組、模型組、陽性藥組和當歸高、中、低劑量組，每組10只。除正常組外，其余各組小鼠第1、4、7、10日皮下注射乙酰苯肼60 mg/kg，第10～14日腹腔注射環磷酰胺40 mg/kg，并予復方地芬諾酯混懸液25 mg/kg灌胃（5 d為1個給藥周期，期間停藥2 d，共4個周期）。

1.5 給藥

實驗第14日起，陽性藥組給予常通舒顆粒溶液5 g/kg（相當于臨床60 kg體質量成人日用量的5倍）灌胃，當歸高、中、低劑量組給予當歸水煎液16.7、8.3、4.2 g/kg（分別相當于臨床60 kg體質量成人日用量的20、10、5倍）灌胃，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。給藥體積10 mL/kg，連續14 d。實驗第28日，頸椎脫臼處死小鼠，迅速開腹取出結腸，分離系膜，取近端結腸約1 cm（距盲腸2 cm處），4%多聚甲醛固定，免疫組化檢測結腸AQP8蛋白表達；取近端結腸約3 cm（距盲腸3 cm處），沿縱軸剖開，冷生理鹽水沖洗后縱向均分，-80 ℃冰箱保存，用于AQP8蛋白和mRNA的檢測；取結腸約1 cm（距盲腸6 cm處），用于結腸腺苷酸環化酶（AC）、環磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）檢測。

1.6 血虛便秘體征檢測

實驗期間觀察記錄各組小鼠活動狀態，毛色，口、鼻、唇、尾顏色及排便情況。

1.7 糞便排出時間測定

第27日，小鼠禁食不禁水12 h，每只小鼠給予5%炭末0.5 mL灌胃，單籠飼養并記錄小鼠首粒黑便排出時間。

1.8 免疫組化檢測結腸水通道蛋白8蛋白表達

采用經典SABC法嚴格按照說明書進行免疫組化染色。400倍光鏡下觀察結腸AQP8的表達部位并攝片，用ImageJ圖像處理軟件，每張切片隨機選5個視野，求平均光密度（AOD），計算AQP8的相對表達量。

1.9 RT-PCR檢測結腸水通道蛋白8 mRNA表達

采用Trizol法提取結腸總RNA，超微量分光光度計測定260 nm和280 nm吸光度，計算OD260/OD280和OD260/OD230，分析RNA的濃度和純度。嚴格按照Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒和GoTaq? qPCR Master Mix（A6001）試劑盒說明書，去除gDNA并合成cDNA，用RT-PCR儀進行擴增。PCR擴增反應條件：95 ℃預變性3 min，95 ℃復性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共循環40次。用2-ΔΔCt法進行分析，以GAPDH為內參，計算AQP8 mRNA的相對表達量。GAPDH引物序列：上游5'-CGTGCCT GGAGAAACCTG-3'，下游5-AGAGTGGGAGTTGA AGTCC-3'，擴增長度242 bp。AQP8引物序列：上游5'-TGGCTGGCCTCTTTGTAGGA-3'，下游5'-GCTGT CATGGTGACTCCTGTT-3'，擴增產物長度200 bp。

1.10 Western blot測定結腸水通道蛋白8蛋白表達

用組織裂解液和PMSF提取結腸總蛋白，BCA法制備蛋白標準曲線，檢測各樣本蛋白濃度。以總蛋白∶上樣緩沖液=3∶1稀釋并變性。制備15%聚丙烯酰胺凝膠，電泳分離并轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉，分別與AQP8抗體（1∶1000）和GAPDH抗體（1∶3000）室溫孵育2 h后，4 ℃過夜，次日，HRP標記的二抗（1∶5000）室溫孵育2 h，滴加適量ECL發光劑，凝膠成像儀手動曝光15 s，采集圖像，用ImageJ軟件分析曝光后AQP8和GAPDH條帶的灰度值，計算AQP8蛋白相對表達量。

1.11 結腸腺苷酸環化酶、環磷酸腺苷、蛋白激酶A含量測定

按照結腸組織∶PBS=1∶9冰上勻漿，4 ℃、3000 r/min離心15 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存，嚴格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.12 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較用t檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 當歸對模型小鼠體征的影響

正常組小鼠活潑好動，被毛密而有光澤，糞便形狀規則，質稍軟，互不粘連；模型組小鼠蜷縮，萎靡，被毛枯疏、易掉、光澤黯淡，耳、鼻、唇、尾蒼白，排便數量減少，糞便干結、粘連；當歸高、中、低劑量組和陽性藥組小鼠上述血虛和便秘體征均有所好轉，反應較為靈敏，毛色恢復光澤，糞便變軟，數量增多。

2.2 當歸對模型小鼠首粒黑便排出時間的影響

與正常組比較，模型組小鼠首粒黑便排出時間顯著延長，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，當歸高、中、低劑量組和陽性藥組小鼠首粒黑便排出時間顯著縮短，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表1。

2.3 當歸對模型小鼠結腸水通道蛋白8蛋白表達的影響

免疫組化染色顯示，AQP8主要在小鼠結腸黏膜上皮細胞和杯狀細胞表達。與正常組比較，模型組小鼠結腸AQP8表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.05）；與模型組比較，當歸高、中、低劑量組小鼠結腸AQP8表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見圖1、表2。

2.4 當歸對模型小鼠結腸水通道蛋白8 mRNA表達的影響

與正常組比較，模型組小鼠結腸AQP8 mRNA表達顯著升高，差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，當歸高、中、低劑量組和陽性藥組小鼠結腸AQP8 mRNA表達顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表3。

2.5 當歸對模型小鼠結腸水通道蛋白8蛋白表達的影響

Western blot檢測顯示，與正常組比較，模型組小鼠結腸AQP8蛋白表達顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，當歸高、中劑量組小鼠結腸AQP8蛋白表達顯著降低（P<0.01）。結果見表4、圖2。

2.6 當歸對模型小鼠結腸AC-cAMP-PKA通路各因子含量的影響

與正常組比較，模型組小鼠結腸AC、cAMP和PKA含量均顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠結腸AC、cAMP和PKA含量均顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表5。

3 討論

中醫認為，血虛是因失血過多、脾胃虛弱、血液生化之源不足或瘀血阻滯導致的血液不足，和/或血的濡養功能減退的一種病理狀態?，F代醫學認為，貧血的成因包括紅細胞生成減少（骨髓造血功能障礙、造血物質缺乏或利用障礙），紅細胞丟失或破壞過多（失血、溶血）等。有研究發現，血虛證癥狀在貧血患者中出現率較高，貧血的中醫證型以血虛證為主[2]。因此，實驗研究常借鑒貧血的研究方法來研究和認識血虛證。目前，便秘動物模型復制和藥物干預的主要指標為糞便排出時間。本研究采用乙酰苯肼+環磷酰胺+復方地芬諾酯聯合復制血虛便秘模型：利用乙酰苯肼緩慢氧化、破壞紅細胞膜；環磷酰胺引起骨髓抑制，使造血細胞生成減少，白細胞和粒細胞數量減少；復方地芬諾酯作用于腸壁阿片受體，降低腸道敏感性，提高平滑肌張力，使腸蠕動減弱，腸內容物滯留時間延長，水分重吸收增多，產生收斂止瀉作用。模型組小鼠首粒黑便排出時間顯著延長。當歸各劑量組均能縮短糞便排出時間。

結腸黏膜表達的AQP8在糞便水分吸收、黏液分泌中發揮重要作用。本研究采用免疫組化、RT-PCR和Western blot 3種方法檢測小鼠結腸AQP8蛋白和基因的表達，結果顯示當歸各劑量組均可明顯降低模型小鼠結腸AQP8蛋白和基因的異常升高。與文獻報道便秘時結腸AQP8的表達一致[5]。

AC是廣泛分布在哺乳動物細胞膜、核膜和內質網膜上的膜整合蛋白，能催化ATP生成cAMP并釋放出焦磷酸。cAMP是細胞內參與調節水液代謝和生理活動的第二信使。PKA又稱為依賴cAMP的蛋白激酶A，PKA與cAMP結合后，能催化靶蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化，從而調節細胞功能。本實驗結果顯示，血虛便秘小鼠結腸中AC、cAMP和PKA均顯著升高，可能致使結腸AQPs的表達和活性增加，水分吸收增多而形成便秘。當歸各劑量組均能顯著降低血虛便秘小鼠結腸AC、cAMP和PKA的含量，推測可能由于AC-cAMP-PKA途徑中各因子含量下降，AQPs的表達和活性減弱，水分重吸收減少，起到潤腸通便作用。

綜上所述，當歸潤腸通便作用機制可能與調節AC-cAMP-PKA信號通路，進而影響結腸AQP8的表達，抑制近端結腸水分吸收、改善結腸潤滑功能有關。

參考文獻：

[1] 李國峰.養血活血方治療血虛型便秘的臨床研究及對便秘模型小鼠結腸ICC的影響[D].北京：中國中醫科學院，2008.

[2] 崔雷.秘寶康對便秘（血虛腸燥）模型小鼠腸道功能的影響[D].鄭州：河南中醫學院，2013.

[3] 智會，袁維堂.水通道蛋白3、4、8在大鼠慢傳輸便秘模型結腸粘膜中的表達[D].鄭州：鄭州大學，2013.

[4] ITOH A， TSUJIKAWA T， FUJIYAMA Y， et al. Enhancement of aquaporin 3 by vasoactive intestinal polypeptide in a human colonic epithelial cell line[J]. Journal of Gastroenterology & Hepatology， 2010，18（2）：203-210.

[5] 錢海華，徐天舒，曾莉，等.通便顆粒調節慢傳輸型便秘大鼠結腸水通道蛋白3和水通道蛋白8表達的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2014， 20（24）：180-184.

（收稿日期：2017-11-16）

（修回日期：2017-12-08；編輯：華強）