截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠血清和肝組織白細胞介素—6、腫瘤壞死因子—α及肝細胞超微結構的影響

侯偉欣 郝玉林 楊文龍 田甜 蔣天媛 張秋云 高連印 杜宇瓊

摘要：目的 觀察截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭（ACLF）大鼠血清和肝組織白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量及肝細胞超微結構的影響，探討其部分作用機制。方法 采用人血清白蛋白免疫誘導肝纖維化聯合D-氨基半乳糖/脂多糖急性攻擊建立ACLF大鼠模型。將SPF級Wistar雄性大鼠隨機分為正常組、模型組和截斷逆挽方組（中藥組），中藥組在急性攻擊24 h后給予截斷逆挽方連續灌胃，5、10、15 d后平行取材。透射電鏡觀察肝細胞超微結構變化，ELISA檢測血清及肝組織IL-6、TNF-α含量。結果 與正常組比較，模型組各時間點大鼠血清及肝組織IL-6、TNF-α含量增加；與模型組比較，中藥組血清及肝組織IL-6、TNF-α呈下降趨勢，15 d改善最明顯。透射電鏡觀察模型組大鼠肝細胞超微結構損傷程度隨時間延長逐漸加重，各對應時間點中藥組損傷程度明顯減輕。結論 截斷逆挽方能有效降低大鼠血清及肝組織IL-6、TNF-α水平，減輕肝細胞損傷，對肝細胞結構和功能有一定的保護作用。

關鍵詞：截斷逆挽方；慢加急性肝衰竭；白細胞介素-6；腫瘤壞死因子-α；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.012

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0049-04

Abstract： Objective To observe the effects of Jieduan Niwan Prescription on IL-6 and TNF-α in serum and hepatic tissue in acute-on-chronic liver failure rats （ACLF）； To study the partial mechanism of the treatment for ACLF. Methods The ACLF rat model was established by using human serum albumin immuno-induced hepatic fibrosis followed with D-galactosamine and lipopolysaccharide joint acute attack. The SPF Wistar male rats were randomly divided into normal group， model group and Jieduan Niwan Prescription group， respectively. The Jieduan Niwan Prescription group was treated by Jieduan Niwan Prescription after the acute attack for 24 h， and the rats were sacrificed respectively at 5， 10 and 15 days after gavage administration. Transmission electron microscope was employed to observe the ultrastructural changes in liver cells and ELISA was used to detect the contents of IL-6 and TNF-α in serum and liver tissue， respectively. Results Compared with the normal group， the contents of serum and liver tissue IL-6 and TNF-α in model group increased at each time point. Compared with the model group， the contents of serum and liver tissue IL-6 and TNF-α decreased in Jieduan Niwan Prescription group， especially in 15 days. Under the transmission electron microscope， the changes of ultrastructure of liver tissue were observed. With the passage of time， the degree of hepatocyte injury in model group gradually increased， but decreased significantly in Jieduan Niwan Prescription group at each time point. Conclusion Jieduan Niwan Prescription can effectively reduce the levels of IL-6 and TNF-α in serum and liver tissue， reduce the degree of liver damage， and has a certain protective

在我國，慢加急性肝衰竭（acute-on-chronic liver failure，ACLF）是威脅生命的重要殺手。目前仍缺乏有效治療措施，該病西醫多采用內科綜合治療、肝移植、人工肝支持治療等，但效果欠佳。全國名中醫錢英教授基于“毒損肝體”理論，結合自身臨床經驗，擬定截斷逆挽方治療ACLF，前期臨床研究證實了該方的有效性[1]，前期實驗表明該方可預防性降低ACLF大鼠血清及肝組織的部分炎癥因子、減輕肝細胞過度凋亡、改善肝組織病理損傷[2-5]。本實驗觀察截斷逆挽方給藥5、10、15 d后大鼠血清及肝組織白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量及肝細胞超微結構變化，揭示其治療ACLF大鼠的部分作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

雄性Wistar大鼠105只，SPF級，體質量180～200 g，北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。飼養于首都醫科大學SPF級實驗動物房，室溫（22.4±3.0）℃，相對濕度（51.3±2.2）%，光照明暗交替12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

截斷逆挽方由苦味葉下珠30 g、瓜蔞30 g、金錢草30 g、黃芪30 g、槲寄生30 g、三七6 g、生地黃20 g、莪術6 g、丹參20 g、黑附片15 g組成，飲片購自北京同仁堂中醫醫院中藥房。根據課題組前期實驗得出有效劑量[3]，濃縮成含原藥材4.34 g/mL。

1.3 主要試劑與儀器

人血清白蛋白（A9731-5G，Sigma公司），D-氨基半乳糖（G0500-25G，Sigma公司），脂多糖（109K4075，Sigma公司），Rat IL-6 ELISA（CRE005，北京四正柏生物科技有限公司），Rat TNF-α ELISA （CRE003，北京四正柏生物科技有限公司）。全自動多功能酶標儀（MULTISKAN MK3，美國Thermo），MINI shaker（MH-1，kylin-Bell Lab Instruments QILINBEIER），電熱恒溫培養箱（DH4000A，天津泰斯特），透射電子顯微鏡（HT7700，日立公司）。

2 實驗方法

2.1 分組、造模及給藥

參照文獻[6]方法建立白蛋白免疫誘導型肝纖維化大鼠模型，5只Wistar雄性大鼠做正常對照，100只第6周行肝組織活檢，肝纖維化Ⅲ級以上大鼠60只，繼續攻擊2周成肝硬化模型。隨機分成模型組和截斷逆挽方組（中藥組），均采用文獻[7]方法同時腹腔注射D-氨基半乳糖400 mg/kg及脂多糖100 μg/kg行急性攻擊。存活并成模大鼠30只。中藥組于急性攻擊24 h后分別給予截斷逆挽方藥液連續灌胃5、10、15 d，正常組和模型組于相同時間點連續給予等體積生理鹽水，給藥體積為5 mL/kg，分別于給藥5、10、15 d后平行取材。取材過程中，由于操作不當，致使中藥5 d組1只大鼠取出很少量血且溶血，不足以進行相關血清檢測，故該只大鼠未行血清檢測。

2.2 血清白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α含量檢測

腹腔注射10%水合氯醛大鼠麻醉，腹主動脈取血，4 ℃、3000 r/min離心15min，采集上層血清，ELISA檢測血清IL-6、TNF-α含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

2.3 肝組織白細胞介素-6、腫瘤壞死因子-α含量檢測

將取下的肝左葉制成10%肝組織勻漿，4 ℃、4500 r/min離心5 min，收集上清液，ELISA檢測肝組織IL-6、TNF-α含量，嚴格按試劑盒說明書操作。

2.4 透射電鏡觀察肝細胞超微結構

肝臟標本經2.5%戊二醛固定2 h，鋨酸固定1 h，梯度乙醇脫水，環氧丙烷置換，環氧樹脂包埋，切片（厚度70 nm），飽和醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察肝細胞及線粒體超微結構，并拍照。

3 統計學方法

采用SPSS23.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間比較用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 截斷逆挽方對模型大鼠血清和肝組織白細胞介素-6含量的影響

與正常組比較，模型組各時間點大鼠血清和肝組織IL-6含量增加，部分時點差異有統計學意義（P<0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠血清10、15 d和肝組織5、15 d IL-6含量明顯降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表1、表2。

4.2 截斷逆挽方對模型大鼠血清和肝組織腫瘤壞死因子-α含量的影響

與正常組比較，模型組各時間點大鼠血清和肝組織TNF-α含量增加，且隨時間推移逐漸上升，于15 d達高峰（P<0.01）；與模型組比較，中藥組大鼠血清和肝組織15 d TNF-α含量明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結果見表3、表4。

4.3 截斷逆挽方對模型大鼠肝細胞及線粒體超微結構的影響

正常組大鼠肝細胞結構完整，細胞核大而圓且居中，異染色質少而分散，細胞膜完整，胞質均勻，發達并排列整齊的粗面內質網和豐富的線粒體廣泛分布于胞質內，線粒體多呈球形或橢球形，嵴發達，雙層膜結構完整。模型組5 d肝細胞腫脹，部分可見血竇受壓，細胞核變形，核染色質凝集，內質網數量減少，其中粗面內質網脫顆粒且擴張明顯，線粒體腫脹變形，基質中空，嵴斷裂或消失，模糊不清。胞漿疏松，胞質內可見包涵體，且脂滴增多。模型組10 d肝細胞核呈現受損變形態勢，核固縮，核染色質邊集，內質網出現斷裂，并片段化，線粒體膜破裂，嵴消失，空淡變形固縮，胞質內明顯可見凋亡小體，肝血竇內充斥大量炎細胞。模型組15 d大量肝細胞核異形現象極為嚴重，核膜嚴重不規則皺縮，肝細胞結構嚴重破壞，殘留少量細胞器且結構不清，內質網結構破壞嚴重，線粒體膜明顯破裂且空泡化，不同階段凋亡小體顯著增多，可見Kupffer細胞吞噬凋亡小體及一些壞死物質。與同一時間點模型組比較，中藥組大鼠肝細胞損傷程度明顯減輕，細胞核稍有變形，給藥15 d后，細胞核出現固縮現象，但核異形較為少見；內質網擴張斷裂，但尚未消失；線粒體腫脹變形，但相比模型組較少出現膜破裂或固縮，炎性細胞浸潤及凋亡小體較模型組顯著減少。結果見圖1、圖2。

5 討論

在我國，ACLF是一種較為常見的重癥肝病，發病機制尚不完全明確。有學者提出“內毒素-巨噬細胞-細胞因子風暴”學說[8-11]。在內毒素的刺激下，誘導機體淋巴細胞、NK細胞和單核-巨噬細胞產生大量TNF-α、IL-6等炎癥介質，引起肝細胞凋亡及壞死。同時，IL-6具有明顯的中性粒細胞趨化及激活作用，能夠損傷血管內皮細胞，從而加重肝臟炎癥細胞浸潤。并且IL-6可激活細胞毒性T細胞及NK細胞，溶解肝細胞，加重肝損傷。研究表明，血清IL-6、TNF-α水平可反映肝衰竭患者肝細胞損傷程度[12-13]。本實驗采用D-氨基半乳糖/脂多糖聯合急性攻擊制備大鼠ACLF模型，其中D-氨基半乳糖干擾肝細胞磷酸尿嘧啶核苷代謝，誘導肝臟過氧化損傷，最終導致肝細胞壞死。脂多糖對肝細胞有直接損傷作用，同時還能下調單核巨噬細胞的吞噬功能并刺激其釋放TNF-α、IL-6等炎性介質，參與肝衰竭的發展。

IL-6和TNF-α是細胞間傳遞信號的重要介質，在ACLF的發生發展過程中起重要作用，通過檢測血清及肝組織IL-6和TNF-α水平可反映肝臟損傷程度。截斷逆挽方預防性干預ACLF大鼠IL-6和TNF-α多有報道[2-5]，但基于二者含量探究截斷逆挽方治療ACLF大鼠療效機制尚無相關報道。本研究通過對正常組、模型組和中藥組各時間點間IL-6和TNF-α水平比較，結果發現，隨時間推移，模型組血清及肝組織IL-6和TNF-α水平逐漸升高，呈遞增趨勢，且于15 d達高峰，這提示ACLF的發生發展與促炎因子TNF-α和IL-6水平升高有關，可能在肝臟損傷等病理過程中起重要作用。經截斷逆挽方干預后，ACLF大鼠血清及肝組織IL-6和TNF-α水平呈降低趨勢，且給藥15 d差異最明顯。表明中藥組可有效降低炎癥因子水平，并且給藥時間越長，作用越顯著。另外，前期預防實驗研究表明，截斷逆挽方可阻斷線粒體凋亡途徑[14]，對減輕肝細胞損傷有一定的預防作用。本實驗通過觀察肝細胞及線粒體超微結構直觀發現：線粒體腫脹變形，隨時間延長，損傷逐漸加重，至15 d破壞嚴重，線粒體空淡、變形、膜破裂顯著增多，殘留少量細胞器且結構不清，肝細胞大量凋亡且炎性浸潤尤為明顯。此時血清及肝組織TNF-α和IL-6水平也達高峰，由此推斷，肝細胞及線粒體結構的破壞可能與炎癥因子TNF-α和IL-6水平升高有關。而各時間點中藥組損傷程度有所減輕，表明中藥組可改善肝細胞超微結構破壞程度，保護肝細胞，延緩病情。

綜上，截斷逆挽方能降低ACLF大鼠血清和肝組織炎癥因子IL-6、TNF-α水平，減輕肝細胞超微結構損傷程度，對肝細胞結構和功能有一定的保護作用。

參考文獻：

[1] 胡建華，錢英，姚乃禮，等.“截斷逆挽法”治療慢性乙型重型肝炎臨床療效觀察[J].中西醫結合肝病雜志，2010，20（4）：200-203.

[2] 崔利娟，黨澤方，張秋云，等.截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6的影響[J].中醫藥導報，2013，19（1）：8-11.

[3] 劉增利，吳文秀，張秋云.“截斷逆挽方”對慢加急性肝衰竭大鼠ET、TNF-α含量的影響[J].中國醫藥導刊，2011，13（4）：650-652.

[4] 穆凌云，李金霞，張秋云，等.截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭模型大鼠血清TNF-α、肝組織p-JNK及c-Jun的影響[J].首都醫科大學學報， 2017，38（2）：282-288.

[5] 崔利娟，吳文秀，邢金麗，等.截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠血清、肝組織TNF-α含量及肝組織TNFR1表達的影響[J].北京中醫藥，2013， 32（2）：134-138.

[6] 王寶恩，王志富，殷蔚荑，等.實驗性免疫性肝纖維化模型的研究[J].中華醫學雜志，1989，69（9）：503-505.

[7] 劉旭華，孟艷英，陳煜，等.采用免疫型肝硬化大鼠建立慢加急性肝衰竭模型方法的研究[J].胃腸病學和肝病學雜志，2008，17（10）：790-793.

[8] CHASTRE A， B?LANGER M， BEAUCHESNE E， et al. Inflammatory cascades driven by tumor necrosis factor-alpha play a major role in the progression of acute liver failure and its neurological complications[J]. PLoS One，2012，7（11）：e49670.

[9] 陳智.肝衰竭發生與發展過程中的免疫機制研究進展[J].中華肝臟病雜志，2012，20（10）：733-736.

[10] GORAL V， ATAYAN， KAPLAN A. The relation between pathogenesis of liver cirrhosis， hepatic encephalopathy and serum cytokine levels ： what is the role of tumor necrosis factor α[J]. Hepatogastroenterology，2011，58（107/108）：943.

[11] NOWAK M，GAINES G C，ROSNBERG J， et al. LPS-induced liver injury in d-galactosamine-sensitized mice requires secreted TNF-α and the TNF-p55 receptor[J]. American Journal of Physiology- Regulatory， Integrative and Comparative Physiology，2000，278（5）：R1202-R1209.

[12] LAI H S， LIN W H，LAI S L， et al. Interleukin-6 mediates angiotensinogen gene expression during Liver regeneration[J]. PLoS One，2013，8（7）：e67868.

[13] SEKIYAMA K D， YOSHIBA M， THOMSON A W， et al. Circulating proinflammatory cytokines （IL-1 beta， TNF-alpha， and IL-6） and IL-1 receptor antagonist （IL-1Ra） in fulminant hepatic failure and acute hepatitis[J]. Clin Exp Immunol，1994，98（1）：71-77.

[14] 李金霞，穆凌云，張秋云，等.截斷逆挽方對慢加急性肝衰竭大鼠線粒體凋亡途徑的影響[J].中國中醫藥信息雜志，2016，23（4）：45-48.

（收稿日期：2018-01-07）

（修回日期：2018-01-24；編輯：華強）