龍膽苦苷納米乳處方優化及其質量評價

夏鵬飛 馬肖 吳國泰 李陽 樊秦 趙磊

摘要：目的 篩選處方并制備龍膽苦苷納米乳，并對其質量進行評價。方法 根據龍膽苦苷的基本性質，基于單因素試驗和偽三元相圖法選擇納米乳處方，對其理化性質進行考察，采用HPLC對其含量進行評價。結果 篩選得到龍膽苦苷納米乳制劑處方為：龍膽苦苷∶乙酸乙酯∶聚氧乙烯醚（35）蓖麻油∶無水乙醇∶水=1.77∶7.66∶5.94∶11.91∶72.71；測得龍膽苦苷納米乳平均粒徑為23.08 nm；建立了HPLC測定龍膽苦苷納米乳中龍膽苦苷含量的方法，專屬性良好，線性范圍為0.004 28～0.214 mg/mL；在不同溫度、光照和濕度條件下含量無明顯變化，穩定性良好。結論 本研究篩選的龍膽苦苷納米乳制備工藝簡單，為提高龍膽苦苷口服生物利用度提供了依據。

關鍵詞：龍膽苦苷；納米乳；制備工藝；質量評價

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2018.07.015

中圖分類號：R283.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2018）07-0062-05

Prescription Optimization and Evaluation of Quality of Gentiopicroside Nanoemulsion

XIA Peng-fei1，2，3， MA Xiao4， WU Guo-tai1，5， LI Yang1，2，3， FAN Qin1，2，3， ZHAO Lei1，2，3

1. Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China； 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines， College of Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 3. Gansu Province Engineering Laboratory for TCM Standardization Technology and Popularization， Lanzhou 730000， China； 4. Second Peoples Hospital of Gansu Province， Lanzhou 730000， China； 5. Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology of TCM of Gansu Province， Lanzhou 730000， China

Abstract： Objective To optimize prescription of gentiopicroside nanoemulsion； To evaluate its quality and security. Methods According to the basic properties of gentiopicroside， single-factor test and pseudo-ternary phase diagram were adopted to optimize prescription of gentiopicroside nanoemulsion. The physicochemical property was investigated， and the content was evaluated by HPLC. Results Optimal prescription was obtained as gentiopicroside/ ethyl acetate/ EL-35/ absolute ethyl alcohol/ ultrapure water （1.77：7.66：5.94：11.91：72.71）； the particle size of nanoemulsion was 23.08 nm； the content of gentiopicroside was determined by HPLC； the specificity of the method was good with a linear range of 0.004 28–0.214 mg/mL； stability of prepared gentiopicroside nanoemulsion was good in the state of different temperatures， illumination intensity and humidity conditions， without significant changes. Conclusion The optimized preparation technology of gentiopicroside nanoemulsion is simple， repeatable and stable， which can provide references for improving the bioavailability of gentiopicroside.

Keywords： gentiopicroside； nanoemulsion； preparation technology； quality evaluation

龍膽苦苷是秦艽、龍膽等龍膽科植物的主要有效成分。研究表明，龍膽苦苷具有明確的保肝利膽、抗炎鎮痛活性[1]，同時還具有抗氧化、抑制腫瘤[2]、中樞興奮、抗病原微生物及增強免疫等作用[3]，臨床可應用于肝炎防治[4]。本課題組前期研究發現，龍膽苦苷對骨關節炎具有一定的治療作用[5]。目前，含有龍膽苦苷的中藥劑型以口服制劑為主[6]。龍膽苦苷為環烯醚萜類化合物，自身極性較大，極易被酸水解，所以口服后在生物體內吸收快、消除快。藥代動力學實驗表明，其在大鼠體內代謝的消除半衰期僅0.64 h[4]，生物利用度較低，嚴重影響龍膽苦苷的藥效發揮和開發利用。

納米乳包括水包油（O/W）型、油包水（W/O）型及雙連續型，是由水相、油相、乳化劑和助乳化劑按適當比例組成的熱力學穩定體系，能夠通過將藥物包裹形成粒徑在10～100 nm之間的球體，達到增加難溶藥物溶解度、提高易水解藥物穩定性的作用，進而達到緩釋、靶向及提高藥物生物利用度的目的[7]，該技術已滲透到生物醫藥、化工、食品等領域，展現出良好的應用前景[8]。本試驗旨在篩選適宜的油相、乳化劑及助乳化劑，制備龍膽苦苷納米乳，以期憑借納米乳的特性，研制一種能夠提高龍膽苦苷穩定性、療效及生物利用度的納米乳制劑，并對其含量、黏度、密度、折光率、粒徑、穩定性等參數進行測定，以評價和控制納米乳制劑的質量。

1 儀器與試藥

Tecnai G2 20型分析透射電鏡，美國FEI公司；Zetasizenano 3600激光納米粒度儀，英國馬爾文公司；JJ-3控溫磁力攪拌器，金壇市恒豐儀器廠；SW22恒溫水域振蕩器，優萊博技術（北京）有限公司；PBJ 420-3M電子分析天平，德國科恩公司；UW620H電子分析天平，日本島津公司；Agilent 1260II Infinity高效液相色譜儀，美國安捷倫公司。

龍膽苦苷（批號20160308），天津士蘭科技有限公司；聚氧乙烯醚（35）蓖麻油（EL-35）、肉豆蔻酸異丙酯（IPM）、聚氧乙烯醚（40）蓖麻油（EL-40）、聚氧乙烯醚（40）氫化蓖麻油（RH40）均為化學純，江蘇省海安石油化工廠；司盤-80、乳化劑OP-10（萊陽市雙雙化工有限公司），乙酸乙酯、無水乙醇、吐溫- 80（天津市大茂化學試劑廠），液體石蠟（天津歐博凱化工有限公司），大豆卵磷脂（天津市凱信化學工業有限公司），丙三醇（國藥集團化學試劑有限公司），均為分析純。液相色譜用試劑為色譜純，水為超純水（本實驗室自制）。

2 方法與結果

2.1 處方篩選

2.1.1 偽三元相圖的繪制

將乳化劑與助乳化劑按一定質量比（Km）混勻形成混合乳化劑，再與油相按Km分別為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1混勻，在磁力攪拌情況下逐滴加入超純水，觀察混合體系的變化，滴定過程中可借助丁達爾現象和偏光顯微鏡來判斷是否形成了納米乳，最終記錄體系由渾濁變為澄清時的臨界加水量。采用OriginPro8.5軟件，以水相、油相及混合乳化劑質量為3個頂點，繪制偽三元相圖[9]，以偽三元相圖中納米乳區域面積的大小作為篩選各相的依據。

2.1.2 水相和油相的選擇

龍膽苦苷極性較大，在水中具有良好的溶解性，溶解度達7.65 g/100 g[10]，因此，選擇超純水為水相，選取乙酸乙酯、IPM、液體石蠟、橄欖油及棕櫚酸異丙酯為待選油相，測定龍膽苦苷在各油相中的溶解度，最終選擇對龍膽苦苷溶解能力較大的乙酸乙酯為油相。

2.1.3 乳化劑和助乳化劑的篩選

乳化劑的選擇要考慮到納米乳本身及其使用目的、經濟性、安全性等問題，是篩選納米乳處方組分最重要的一步。本研究選擇OP-10乳化劑、RH-40、吐溫-80、EL-35及EL-40為待選乳化劑。根據乳化理論和納米乳的特性，納米乳的形成需要有助表面活性劑提供短暫的負表面張力作用。醇類為應用最廣泛的助表面活性劑，不僅可以協助表面活性劑降低界面張力，增加界面流動性，調節表面活性劑的親水疏水平衡值（HLB），還可以增大藥物溶解度，增大納米乳區域面積。因此，本研究選擇無水乙醇、異丙醇、正丁醇及1，2-丙二醇為待選助乳化劑。在考察乳化劑時選擇無水乙醇為助乳化劑，按“2.1.1”項下方法繪制偽三元相圖，以圖中納米乳區域面積大小作為選擇乳化劑及助乳化劑的依據，結果見圖1、圖2，最終選擇EL-35為乳化劑，無水乙醇為助乳化劑。

2.1.4 乳化劑與助乳化劑比例篩選

分別將EL-35與無水乙醇按Km分別為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3混合，再按“2.1.1”項下方法繪制偽三元相圖，以圖中納米乳區域面積大小作為選擇Km值的依據，結果見圖3。可以看出，Km分別為2∶1、1∶2時，偽三元相圖中納米乳區域較大，考慮到無水乙醇對納米乳制劑的良好影響，因此選擇Km=1∶2。

2.1.5 龍膽苦苷納米乳的制備

以偽三元相圖和藥物穩定性為依據，龍膽苦苷納米乳的處方組成為：龍膽苦苷∶乙酸乙酯∶EL-35∶無水乙醇∶水=1.77∶7.66∶5.94∶11.91∶72.71。按照該比值對各組分進行稱取，室溫下將龍膽苦苷溶于超純水中，攪拌的同時加入乙酸乙酯、EL-35、無水乙醇，得到澄清透明的龍膽苦苷納米乳。

2.2 理化性質考察

2.2.1 外觀和類型鑒別

正常光照下觀察，龍膽苦苷納米乳為淡藍色、澄清透明的液體，流動性良好，激光束照射呈現丁達爾效應。納米乳類型的鑒別采用染色法[11]，根據紅色的油溶性染料蘇丹紅Ⅲ和藍色的水溶性染料亞甲蘭在納米乳中擴散的快慢來判斷，藍色的擴散速度大于紅色則納米乳為O/W型，反之則為W/O型，二者相同則為雙連續型。結果表明，本試驗研制的龍膽苦苷納米乳為O/W型。

2.2.2 密度、黏度、折光率和pH值

采用比重瓶測定龍膽苦苷納米乳的密度為1.009 9；采用奧氏黏度計測定龍膽苦苷納米乳的黏度為4.443 7×10-3 Pa·s；采用阿貝折光儀測定龍膽苦苷納米乳的折光率為1.344 8；采用酸度計測定龍膽苦苷納米乳的pH值為6.049。

2.2.3 形態

將龍膽苦苷納米乳滴在覆有支持膜的銅網上，靜置10 min后滴加3%磷鎢酸溶液于銅網上負染5 min，自然揮干，透射電鏡下觀察納米乳的形態呈圓球形，分布均勻（見圖4）。

2.2.4 粒徑和粒度分布

取適量龍膽苦苷納米乳，采用激光納米粒度儀進行測定，納米乳的粒徑分布見圖5。結果表明，龍膽苦苷納米乳的粒徑主要集中在10～100 nm之間，平均粒徑為23.08 nm，多分散系數（PDI）為0.24。

2.3 龍膽苦苷含量測定

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo ODS HYPERSIL柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（25∶75）；流速：1 mL/min；檢測波長：275 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL。

2.3.2 標準曲線的建立

精密稱取龍膽苦苷對照品0.010 7 g，用甲醇溶解并定容于50 mL量瓶中，得到濃度為0.214 mg/mL的貯備液，于4 ℃保存。精密吸取貯備液0.1、0.2、0.3、0.4、0.7、5.0 mL，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇定容，得龍膽苦苷系列濃度溶液，按“2.3.1”項下色譜條件進行測定，以峰面積對龍膽苦苷濃度進行線性回歸，得標準曲線回歸方程Y=12 053X+6.111（r2=1），表明龍膽苦苷在0.004 28～0.214 mg/mL范圍內有良好的線性關系。

2.3.3 供試品溶液的制備

精密稱取樣品適量，置于10 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲30 min破乳，靜置10 min，取續濾液，用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，即得。

2.3.4 專屬性考察

取龍膽苦苷對照品溶液、空白納米乳、龍膽苦苷納米乳按，“2.3.1”項下色譜條件進行測定，色譜圖見圖6。可見，龍膽苦苷色譜峰無干擾，峰形良好。

2.3.5 方法學考察

重復性試驗，穩定性試驗，日間、日內精密度試驗RSD均小于3%，加樣回收率為99.4%。

2.4 穩定性考察

龍膽苦苷納米乳10 000 r/min離心10 min，仍保持澄清透明，未出現分層、沉淀；室溫密封放置90 d，仍保持澄清透明，無分層、藥物析出現象；將龍膽苦苷納米乳置于高溫（40 ℃）、低溫（4 ℃）及光照（4500±500）Lx、相對濕度92.5%條件下，分別于0、3、7 d取樣進行含量測定，結果見表1。可見，龍膽苦苷納米乳在上述條件下含量、性質保持穩定。

3 討論

納米乳是超微米大小的膠體微粒系統，可以增強藥物的生物利用度，提高藥物的治療效果及物理穩定性，提高親脂性藥物的溶解性，掩蓋原料藥苦味，可制成多種多樣的劑型，用于注射給藥、黏膜給藥、口服給藥及經皮給藥，擴大藥物的使用范圍。

本試驗基于單因素法結合偽三元相圖法對納米乳的處方進行篩選優化，得到了龍膽苦苷納米乳的最佳處方，同時使處方中油相、乳化劑及助乳化劑的比例降至最低，以減少其對機體的影響；通過考察納米乳的理化性質，保證制劑工藝的合理；通過建立含量測定的方法，對納米乳的質量進行控制；通過測定穩定性，保證納米乳制劑在非正常狀態下仍能保持性質、含量的穩定。

龍膽苦苷具有明顯抗炎鎮痛作用[12-13]，因良好的活性展現出巨大的潛在優勢。但其極性較大，口服后吸收快、消除快，導致生物利用度較低。將龍膽苦苷制成納米乳制劑可減小極性，提高放置穩定性，借助納米乳形成包裹物減慢其在體內的吸收、代謝速度。

龍膽苦苷在水中具有良好的溶解度，使龍膽苦苷納米乳的載藥量得到了保障。選擇乙酸乙酯為油相，廣泛應用于醫藥產業；選擇EL-35為乳化劑，所得偽三元相圖納米乳區域較大，能滿足作為藥物原料時的臨床要求；醇類是常用的助乳化劑，能增大藥物溶解度，提高載藥量，通過自身的剪切作用減小納米乳的粒徑，最終選擇無水乙醇為助乳化劑。本研究制備的龍膽苦苷納米乳為O/W型納米乳，可用大量水進行稀釋，自由調節濃度，使用方便，并且可開發成其他劑型，擴大適用范圍。本研究結果可為提升龍膽苦苷口服生物利用度及擴大臨床應用提供參考依據。

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（收稿日期：2017-06-13）

（修回日期：2017-09-14；編輯：陳靜）