咪喹莫特對BALB/c和C57BL/6小鼠銀屑病樣皮損誘導作用的比較

吳劍平，謝 倩，陳 林，張軍峰，史麗云，詹 瑧

(南京中醫藥大學，南京 210023)

銀屑病是以皮膚反復出現炎性增生為典型表現的自身免疫性疾病，目前其發病機制尚未完全闡明[1-2]。咪喹莫特作為Toll樣受體激動劑，可通過與TLR-7/8結合，誘導皮膚出現表皮增厚、棘層肥厚、角化不全、嗜中性粒細胞聚集等銀屑病樣表現，目前常被用于銀屑病動物模型的誘導劑[3]。BALB/c和C57BL/6小鼠是目前最常用于該類動物模型研究的兩種小鼠品系，但這兩種模型有無差異，哪種模型更適用于人類銀屑病研究則鮮見報道。本研究即采用BALB/c和C57BL/6兩種小鼠品系，比較不同時間點咪喹莫特誘導的兩種模型小鼠皮膚形態學、病理組織學等方面的差異，并探討IL-23/IL-17炎癥軸在模型進展中的作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠各24只，均為雌性，體重20～22 g， 7～8周齡，由北京維通利華實驗動物技術有限公司南京分公司提供[SCXK (蘇) 2016-0003]。實驗期間小鼠均飼養在屏障環境[SYXK (蘇) 2014-0001]中，按照國標GB 14925-2010[4]的有關要求控制環境參數。實驗前先給予3 d健康適應期，飼養和實驗期間動物自由飲食。

1.2 主要試劑與儀器

明欣利迪乳膏(5%咪喹莫特)購自四川明欣藥業有限責任公司；SuperScriptTMIII First-Strand Synthesis SuperMix購自Invitrogen公司；實時熒光定量PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；Power SYBR? Green PCR Master Mix購自Applied Biosystems公司。Olympus顯微鏡購自日本；CFX384多重實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組處理

咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病模型觀察期多為4～6 d[3, 5-6]，故本研究選擇6 d作為模型觀察終點。BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠均隨機分為4組，每組6只，分別為涂藥0 d組(即正常對照組)、涂藥2 d組、涂藥4 d組和涂藥6 d組。

各組處理如下：動物于涂藥前一天背部剃毛，形成約2 cm × 3 cm大小的皮膚暴露區。涂藥組小鼠每天涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg，并分別于涂藥后2 d(涂藥2 d組)、4 d(涂藥4 d組)、6 d(涂藥6 d組)采樣。涂藥0 d組小鼠背部剃毛后，不做任何處理，第2天直接采樣。采樣時小鼠先頸椎脫臼處死，剪下背部涂藥部位皮膚，分成兩塊，一塊放入10%甲醛中固定，另一塊放入-80℃凍存。本實驗研究的IACUC號為ACU170704，實驗過程中嚴格按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.3.2 皮損嚴重程度(psoriasis area and severity index，PASI)評分

PAIS評分標準如下：0，無；1，輕度；2，中度；3，重度；4，極重度。采用相機每天拍照記錄小鼠皮損情況，同時按PAIS標準對皮膚紅斑(erythema)、鱗屑(scales)及浸潤增厚程度(thickness)進行0～4的評分，將3種積分累計得到總積分。繪制各組小鼠積分變化趨勢圖，觀察各組小鼠皮損的變化情況。

1.3.3 皮損病理組織學檢測

HE染色觀察小鼠皮膚有無變性、壞死、潰瘍、痂皮形成，上皮層有無增厚、表面角化不全或角化過度、真皮或皮下組織內有無充血、水腫、炎細胞浸潤等病變。之后在200倍光鏡下，采用計算機圖像分析系統(DP2-BSW)測量每只動物的表皮層厚度。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測

采用實時熒光定量PCR(RT-PCR)法測定各組小鼠皮膚組織IL-23/IL-17軸相關免疫因子IL-23、IL-17A和IL-17F mRNA的相對表達量。以β-actin為內參，實驗結果采用2-△△Ct法進行相對定量。各引物序列如下：IL-23(上游)：5’-AACAACAGCTCGGATTTGGTAT-3’；IL-23(下游)：5’-ATGACCAGGACATTCAGCAGT-3’；IL-17A(上游)：5’-TCAGCGTGTCCAAACACTGAG-3’；IL-17A(下游)：5’-CGCCAAGGGAGTTAAAGACTT-3’；IL-17F(上游)：5’-TGCTACTGTTGATGTTGGGAC-3’；IL-17F(下游)：5’-CAGAAATGCCCTGGTTTTGGT-3’；β-actin(上游)：5’-CTGAGAGGGAAATCGTG CGTGAC-3’；β-actin(下游)：5’-GAACCGCTCG TTGCCAATAGTGAT-3’。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組背部皮膚形態學變化

如圖1可見，正常對照組(0 d組)小鼠皮膚均光滑，無鱗屑、皺褶、紅斑等。涂藥2 d后，BALB/c小鼠背部即開始出現細小鱗屑和點狀紅斑。第3天開始出現少量皺褶。涂藥4 d后，背部皮膚明顯增厚，鱗屑變為小塊狀、紅斑連成片狀，皺褶呈條狀隆起。涂藥6 d后，鱗屑開始部分脫落，脫落部位可見點狀出血。與BALB/c小鼠比較，C57BL/6小鼠于涂藥3 d后才出現少量鱗屑及點狀紅斑，之后癥狀緩慢加重。同一時間段比較，C57BL/6小鼠鱗屑、皺褶、紅斑、皮膚增厚等癥狀均較輕，至涂藥第6天鱗屑未見脫落。見圖1。

2.2 各組背部皮損PAIS評分變化

按PAIS評分標準繪制病變積分趨勢線，隨涂藥天數增加，病變積分逐漸增高，與形態學觀察結果一致，且同一時間段BALB/c小鼠的積分均高于C57BL/6小鼠，差異有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)。見圖2。

2.3 背部皮損病理組織學變化

HE染色結果可見，正常組皮膚較薄，表面有少量角化，無充血、出血及炎癥細胞浸潤。涂藥2 d后表皮開始出現增厚，皮膚表面出現痂皮及少量角化。真皮可見輕度充血及少量炎細胞浸潤，以中性粒細胞和單核巨噬細胞浸潤為主。與同時間段C57BL/6小鼠比較，BALB/c小鼠皮膚增厚及角化不全較重。涂藥4 d后，BALB/c小鼠鱗狀上皮和表皮增厚、角化不全、炎癥浸潤等情況均較C57BL/6小鼠嚴重。涂藥6 d后，BALB/c小鼠被覆厚層鱗狀上皮，表皮進一步增厚，角化不全嚴重，真皮層有輕度充血、出血，炎癥細胞浸潤增多。與BALB/c小鼠比較，C57BL/6小鼠表皮增厚、角化不全等病變程度明顯較輕。通過表皮厚度測量可見，2 d組、4 d組和6 d組BALB/c小鼠表皮厚度均大于同時間段C57BL/6小鼠，差異均有顯著性(P< 0.05或P< 0.01)。見圖3。

圖1 不同品系小鼠背部皮膚形態學變化Figure 1 Morphological changes of mouse back skin in different strains

注：同一時間點，BALB/c小鼠與C57BL/6小鼠比較，*P< 0.05，**P< 0.01。圖2 小鼠背部皮損PASI評分變化趨勢圖Note. BALB/c mice compared with C57BL/6 mice at the same time,* P< 0.05,**P< 0.01.Figure 2 The PASI scores of skin lesions in the mouse

注：A：涂藥局部皮膚病理組織學變化(HE染色，× 100)；B：表皮厚度變化。同一時間點，BALB/c小鼠與C57BL/6小鼠比較，* P< 0.05，**P< 0.01。圖3 各組小鼠皮損病理組織學的變化Note. A: Histopathological changes of the local skin after drug was applied. HE staining (× 100). B: Changes of epidermal thickness. BALB/c mice compared with C57BL/6 mice at the same time,* P< 0.05,**P< 0.01.Figure 3 The histological changes of mouse skin lesions

注：與BALB/c小鼠0 d組比較，* P< 0.05，**P< 0.01；與C57BL/6小鼠0 d組比較，# P< 0.05，## P< 0.01。圖4 不同品系小鼠皮損組織IL-23、IL-17A、IL-17F mRNA的相對表達量Note. Compared with BALB/c mice of the 0 d group,* P< 0.05,**P< 0.01. Compared with C57BL/6 mice of the 0 d group,# P< 0.05,## P< 0.01.Figure 4 The relative expression of IL-23, IL-17A, and IL-17F mRNA in skin lesions of different strains of mice

2.4 IL-23/IL-17軸相關細胞因子mRNA的表達

BALB/c和C57BL/6小鼠在造模后，其IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA相對表達量均呈拋物線樣變化。與0 d組比較，兩種小鼠在造模2，4，6 d后，IL-23、IL-17A、IL-17F均有明顯升高(P< 0.05或P< 0.01)。其中，BALB/c小鼠IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA表達水平在用藥2 d后即達到峰值，之后逐漸降低。C57BL/6小鼠IL-23、IL-17A、IL-17F的mRNA表達水平在用藥4 d后達到峰值，之后逐漸降低。見圖4。

3 討論

銀屑病是目前最常見的自身免疫性疾病之一，發病率高達2%左右[7-8]。其病因及發病機制尚未完全闡明，且尚無有效的治愈方法[9]。銀屑病的臨床特點主要為反復發作的皮膚過度角化、鱗屑、紅斑形成，并伴有炎細胞浸潤、新生血管形成、IL-6、TNF-α等細胞因子的分泌。銀屑病的動物模型有多種，如藥物誘導型模型、陰道上皮模型、基因突變及轉基因模型等[10-12]。咪喹莫特誘導的小鼠模型，因其制作方法簡單、致病機制與人類銀屑病類似等原因，近年來被廣泛用于人類銀屑病研究[3, 13-14]。據文獻報道及本實驗室以往的研究經驗發現，該方法誘導的模型，一般于造模第6天銀屑病樣癥狀達高峰，之后癥狀逐漸減弱直至完全緩解，因此模型觀察期一般以6 d為宜[3, 15-16]。

本研究顯示，通過背部連續6 d涂抹62.5 mg的5%咪喹莫特乳膏(明欣利迪)后，可誘導BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠逐漸出現鱗屑、紅斑、皮膚增厚及皺褶等典型銀屑病樣皮損，病理組織學鱗狀上皮與表皮增厚、角化不全、角化過度、真皮充血、出血、炎癥細胞浸潤等改變均類似人類銀屑病表現。但同時間段兩種模型動物比較，BALB/c小鼠銀屑病樣癥狀出現更早、進展更迅速，且癥狀更嚴重，銀屑病樣皮損更典型。于涂藥2～3 d后，BALB/c小鼠即開始出現細小鱗屑、紅斑等癥狀，4 d后鱗屑、皮膚增厚、紅斑等癥狀逐漸加重，到第6天達高峰。PAIS評分各項指標比較，BALB/c小鼠也均高于C57BL/6小鼠。HE染色發現，隨著涂藥天數的增加，兩種動物模型表皮增厚、皮膚表面痂皮、角化不全、真皮充血、出血、炎癥細胞浸潤等表現均逐漸加重。但與形態學改變一致，BALB/c小鼠的各項病理指標變化均更顯著且典型。

相關文獻報道，咪喹莫特作為Toll樣受體(TLR-7/8)激動劑，其誘導小鼠銀屑病樣皮損的機制與IL-23/IL-17軸的激活有關[3, 17]。本研究同時測定了IL-23/IL-17軸相關細胞因子的表達。結果發現，BALB/c小鼠的IL-23、IL-17A和IL-17F等細胞因子的表達在涂藥2 d后即達高峰，之后逐漸回落，而C57BL/6小鼠在涂藥4 d后各項細胞因子才達高峰，之后逐漸回落，該結果與van der Fits等人[3]的結果趨勢一致，提示在咪喹莫特誘導的銀屑病模型中，IL-23/IL-17軸的激活要先于銀屑病樣皮損的出現，也進一步揭示IL-23/IL-17軸的激活是皮損出現的誘導因素。同時BALB/c小鼠IL-23/IL-17軸的激活要先于C57BL/6小鼠，提示IL-23/IL-17軸的優先激活是BALB/c小鼠模型進展更加迅速的主要原因之一。

綜上可見，咪喹莫特可誘導BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠皮膚均出現銀屑病樣皮損表現，其中BALB/c小鼠癥狀出現更早，進展更迅速，鱗屑、皮膚增厚、角化過度及不全、炎癥細胞浸潤等皮損改變更典型。鑒于該模型病程短，且具有自限性等特點，BALB/c小鼠可能更適合用于人類銀屑病研究。此外，本研究表明IL-23/IL-17軸的激活可能是誘發小鼠銀屑病樣皮損的關鍵因素之一。