復方阿膠漿對小鼠子宮內膜作用研究

丁桂清，魏華芳，王立群，朱楚超，王 晶*

(1.湖北中醫藥大學，武漢 430070； 2.中國人民解放軍武漢總醫院婦產科，武漢 430070)

復方阿膠漿是由阿膠、紅參、熟地黃、黨參、山楂所組成的中藥復方制劑，具有補氣養血之功效。近年來，由于該藥服用方便且口感較好，已被廣大患者所接受，并在貧血以及化療后骨髓抑制、免疫力低下等疾病的治療上取得了較好療效[1-2]。同時，該藥物在婦科疾病中的應用也逐漸增多，臨床研究發現，其不但可以用于治療女性月經不調[3-4]，而且可改善卵巢功能[5]，輔助促排卵治療，并增加患者子宮內膜厚度，提高子宮內膜容受性[6]。然而，目前關于復方阿膠漿對子宮內膜功能方面影響的研究仍較少，我們仍然不清楚復方阿膠漿是否對子宮內膜有作用。本研究通過觀察去勢及假手術小鼠在復方阿膠漿灌胃后的子宮變化情況，探討其對子宮內膜的作用及其可能的作用機制，旨在為臨床用藥提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級C57雌性小鼠50只，8～9周齡，體質量18～20 g，來源于湖北省疾控中心[SCXK (鄂) 2015-0018]。所有動物飼養于中國人民解放軍武漢總醫院醫學實驗科[SYXK (鄂) 2017-0065]，光照周期為12 h，室溫(20±1)℃，自由飲食。通過陰道圖片連續觀察兩個動情周期，取動情周期正常小鼠40只用于實驗。

1.2 主要試劑與儀器

藥物：復方阿膠漿，主要成分為：阿膠、紅參、熟地黃、黨參、山楂，規格：20 mL/支，山東東阿阿膠股份有限公司生產，國字準號：Z20083345。

VEGF-A抗體購自Abcam(ab1316)；β-actin抗體購自Proteintech(20536-1-AP)；小鼠IgG-免疫組化試劑盒購自武漢博士德；HRT標記羊抗鼠二抗購自Biosharp；DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶；BCA蛋白濃度定量試劑盒購自碧云天；PVDF膜購自美國Millipore。RM2016石蠟切片機：上海徠卡儀器有限公司；YD-6L生物組織包埋機：金華市益迪醫療設備有限公司；恒溫培育箱：上海市躍進醫療器械廠；Olympus BX51光學顯微鏡照相系統：日本Olympus；RT-6500型酶標儀：美國Rayto公司；DYCZ-24DN型垂直電泳槽：北京六一儀器廠；DYCZ-40型電轉儀：北京六一儀器廠；TS-1型水平搖床：江蘇海門其林貝爾公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物分組

實驗動物隨機分為4組：假手術組、假手術中藥組、去勢組及去勢中藥組，每組10只。

1.3.2 動物造模

去勢小鼠予完整摘除雙側卵巢，首先用10%水合氯醛麻醉小鼠(0.4 mL/100 g)。使小鼠左側臥位，消毒后自小鼠背部肋骨下靠脊柱處開口進入腹腔，用眼科鑷找出卵巢并將其完整摘除后縫合皮膚，右側同理，待小鼠自然蘇醒。假手術組操作步驟同兩去勢組，但只剪去卵巢周圍部分脂肪組織，不損傷卵巢。術后小鼠恢復3 d后行陰道涂片5 d，若兩去勢組小鼠動情周期消失，兩假手術組動情周期正常即為造模成功。本實驗已經由實驗動物使用與管理委員會批準[倫理證號：20170239號]，動物飼養及處理按照實驗動物使用的3R原則給予人道主義關懷。

1.3.3 給藥方法

假手術中藥組及去勢中藥組每天上午予復方阿膠漿灌胃，根據人和動物體表面積等效劑量換算[7]，以許文生氏公式計算人的體表面積，再以Meeh-Rubner氏公式計算小鼠體表面積，將168 cm/55 kg女性用藥劑量換算為20 g小鼠得到0.25 mL/只，假手術組及去勢組給予等量生理鹽水，共計15 d。于第15天灌胃后，斷頸處死小鼠，取出子宮，一部分用多聚甲醛固定后石蠟包埋，另一部分-80℃凍存。

1.3.4 HE染色

將厚度為4 μm的石蠟切片常規脫蠟至水，蘇木素染色1.5 min，水洗，1%鹽酸酒精分色10 s，自來水返藍5 min，伊紅染色10 s，無水乙醇終止反應，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察各組子宮內膜形態學變化。

1.3.5 免疫組化

切片常規脫蠟至水，3% H2O210 min，檸檬酸抗原熱修復5 min，自然冷卻后重復一次，10%山羊血清37℃封閉30 min，一抗VEGF-A(1∶200)4℃過夜，二抗(1∶150)、SABC(1∶150)37℃，30 min，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片。PBS代替一抗為陰性對照。顯微鏡拍照，采用圖像分析系統分析實驗結果。

1.3.6 Western blot

子宮組織提取蛋白后行蛋白濃度測定，統一蛋白濃度為6 μg/μL。使用SDS-PAGE電泳分離蛋白，每組上樣量為6 μL。150 mA恒流轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗VEGF-A(1∶200)室溫孵育1.5 h，HRT標記二抗(1∶2000)室溫孵育2 h，洗膜后ECL發光液顯色曝光。并以β-actin作為內參。測量各組VEGF-A的灰度值與β-actin比值后作為相對表達量進行對比。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色觀察子宮內膜形態學變化

與假手術組相比，假手術中藥組子宮增大，內膜增厚，子宮腺體數目多，腺腔大，間質水腫(圖1A、1B)；去勢組和去勢中藥組子宮結構完整，但均出現萎縮，與去勢組相比，去勢中藥組子宮內膜略厚，腺體結構清楚，但差異不明顯(圖1C、1D)。

2.2 免疫組化觀察復方阿膠漿對VEGF-A表達的影響

VEGF-A在子宮中主要表達于子宮內膜腔上皮和腺上皮細胞，間質細胞中表達較少。假手術中藥組中VEGF-A的表達量顯著高于假手術組(P< 0.05)；雌鼠去勢后子宮內膜中VEGF-A的表達明顯減少；去勢中藥組中VEGF-A的表達高于去勢組，但差異無顯著性。見圖2、表1。

2.3 Western blot檢測子宮VEGF-A蛋白表達量差異

將假手術組及假手術中藥組子宮組織進行Western blot檢測，以β-actin蛋白作為內參，比較兩組間VEGF-A的蛋白表達量，結果如圖3。結果顯示：復方阿膠漿灌胃可顯著上調假手術組子宮內膜VEGF-A的表達。

注：A：假手術組；B：假手術中藥組；C：去勢組；D：去勢中藥組。圖1 各組子宮組織形態(HE染色，× 100)Note. A: Sham operation group; B: sham operation with Chinese medicine group; C: ovariectomized group; D: ovariectomized with Chinese medicine group.Figure 1 Uterine tissue morphology in each group. HE staining

組別Groups子宮內膜VEGF-A表達(OD值)VEGF-A expression in endometrium (OD value)假手術組Sham operation group0.30±0.03假手術中藥組Sham operation with Chinese medicine group0.51±0.03*去勢組Ovariectomized group0.20±0.01去勢中藥組Ovariectomized with Chinese medicine group0.21±0.02

注：與假手術組相比，*P< 0.05。

Note. Compared with the sham operation group,*P< 0.05.

3 討論

復方阿膠漿主要由阿膠、紅參、熟地、黨參、山楂等中藥組成，為補益氣血之良品。方中君藥阿膠屬“血肉有情之品”，與熟地配伍起補血滋陰之功效；紅參大補元氣，能益氣生津，根據“氣能生血”理論，氣足則血亦旺。中醫認為“肝主藏血”，而肝與腎“乙癸同源”，故氣足血旺，則腎精充沛，沖任有養。因此，中醫學者認為復方阿膠漿可用于治療氣血不足、腎氣虧虛、沖任不調等一系列病癥，推測其可用于調節“腎-天癸-沖任-胞宮”生殖軸的功能。現代研究亦發現補腎調沖任類中藥能夠起到調節生殖軸的作用[8]，例如改善卵巢功能、增加卵巢及子宮動脈血流、改善子宮內膜微環境等。

姚麗雯等[9]研究發現單用復方阿膠漿對患者體內激素水平的影響與單用克羅米芬無明顯差異，且當二者合用時，可更有效地調節患者體內性激素水平，促進卵巢排卵。此外，有臨床研究表明，復方阿膠漿可用于調節女性月經、治療卵巢早衰[3-5]，說明復方阿膠漿可調節女性體內性激素的分泌，調節卵巢功能。本實驗結果顯示：復方阿膠漿對雌鼠子宮內膜形態有一定影響，其可促進假手術組雌鼠子宮內膜生長及腺體發育。而當雌鼠去勢后卵巢缺失時，子宮出現萎縮，復方阿膠漿促進子宮內膜生長及腺體發育的作用效果并不顯著。因此，我們推測復方阿膠漿可能是通過調節卵巢的內分泌功能從而間接影響子宮內膜的生長及腺體發育。

注：A：假手術組；B：假手術中藥組；C：去勢組；D：去勢中藥組。圖2 各組小鼠子宮組織中VEGF-A的表達(× 400)Note. A: Sham operation group; B: sham operation with Chinese medicine group; C: ovariectomized group; D: ovariectomized with Chinese medicine group.Figure 2 The expression of VEGF-A in the uterine tissues in each group

注：與假手術組相比，* P< 0.05。圖3 子宮VEGF-A蛋白表達量Western blot檢測結果Note. Compared with the sham operation group,* P< 0.05.Figure 3 Western blot results of VEGF-A protein expression in uterus

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)家族是一系列參與血管再生的糖蛋白，目前人們在哺乳動物中發現的主要包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及胎盤生長因子。其中VEGF-A為一種特異性的促血管內皮細胞絲裂原，具有促進血管內皮細胞分裂、增生、誘導血管產生及改善血管通透性等作用[10]。VEGF-A的表達異常常導致許多與血管新生相關疾病的發生，如腫瘤、視網膜病變、腎臟病變、子宮內膜異位癥等[11-12]。同時，VEGF-A與女性生殖系統關系密切，其表達于女性子宮內膜，并隨月經周期發生周期性變化。國內外實驗均發現在實驗動物行卵巢切除術后，子宮內膜中VEGF-A的表達量明顯減少[13-14]。此次實驗中，我們亦發現小鼠去勢后，子宮出現萎縮，且子宮內膜中VEGF-A的表達量也明顯減少，這與之前的研究結果相一致[13-14]，證明卵巢可調節子宮內膜中VEGF-A的表達水平。由于雌、孕激素可以使子宮內膜細胞分泌的VEGF-A水平增加[15]，Huang等[16]亦通過實驗證明了雌激素能夠誘導子宮內膜中VEGF-A的遷移及表達，說明VEGF-A的表達受雌、孕激素的調節。此次實驗中我們發現復方阿膠漿灌胃使假手術組小鼠子宮內膜中VEGF-A的表達上升，但并未對去勢小鼠子宮內膜中VEGF-A的表達量產生明顯影響，因此，我們猜想：復方阿膠漿可能通過調節卵巢雌、孕激素的分泌，進而影響子宮內膜中VEGF-A的表達，影響子宮內膜的功能。

在女性妊娠過程中VEGF-A起著至關重要的作用[17]，當處于種植窗口期時，子宮內膜中的VEGF-A表達量明顯增多，其可通過調節子宮內膜微環境而促進胚胎植入[18]，而當其缺失時，胚胎無法完成成功植入。在輔助生殖的相關研究中發現，促排卵后子宮內膜中VEGF-A表達較正常子宮明顯減少，VEGF-A表達的減少也被認為是影響胚胎植入的因素之一[19]，近年來VEGF-A已被許多學者視為評價子宮內膜容受性的指標之一。因此次研究中我們發現復方阿膠漿可增加子宮內膜厚度及子宮內膜中VEGF-A的表達量，故推測其可通過調節子宮內膜環境而改善子宮內膜容受性。近年來，輔助生殖技術雖在不斷發展，但臨床妊娠率仍未滿足患者期望，許多育齡期婦女因排卵障礙、卵巢早衰、子宮內膜容受性差等原因而不能成功妊娠，復方阿膠漿作為一種中藥復方之劑，其無明顯副作用，且可調節女性生殖內分泌軸，調節卵巢功能，改善子宮內膜容受性，或可成為臨床輔助不孕癥治療的新選擇。

總之，通過此次實驗，我們發現復方阿膠漿對子宮內膜形態學及微環境確實存在一定影響，其可能是通過調節卵巢功能而間接作用于子宮，但有關其對卵巢的作用及作用機制，是否能夠直接影響卵巢雌、孕激素的分泌，還有待進一步研究。