樹鼩膽石模型與消化道P物質相關的研究

呂龍寶，陳麗雄，王俊斌，劉汝文，陳麗玲

(1.中國科學院昆明動物所，昆明 650032； 2.中國醫學科學院醫學生物學研究所，昆明 650118； 3.昆明醫科大學實驗動物學部，昆明 650500； 4.昆明醫科大學臨床技能中心，昆明 650500)

隨著經濟的發展，人們生活水平的提高、生活方式和飲食結構的改變，肉食增加導致脂肪肝、膽囊結石的發病率逐年升高，已經成為臨床中的常見病、多發病。膽囊結石形成的機制尚不十分清楚[1]。膽囊結石動物模型建立方法簡單、效果確切，可以為研究膽結石成因及其防治提供巨大方便。樹鼩在眾多的人類疾病替代模型中，很少有人用其研究膽囊結石。飲食誘導樹鼩膽囊膽固醇結石形成過程中，消化道屏障功能可能存在異常，雖然樹鼩食物排空比其它動物快，但成模周期相對快速。本文從消化道P物質(substance P，SP)的免疫組織含量分析研究樹鼩膽石癥的相關性及其膽石模型的建立方法。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

據3R原則盡量減少動物使用量，從中國科學院昆明動物研究所動物實驗中心購買36只普通級成年樹鼩Ⅰ級(F3代)，規格：雌∶雄(1∶1)，體重121～140 g[SCXK (滇) K2017-003]。分組：對照組6只，膽固醇低、中、高劑量組各10只樹鼩。所有動物在實驗前預適應飼養在中國科學院昆明動物研究所動物實驗中心的普通環境2周后再進行實驗；樹鼩采用單籠飼養，人工光照12 h(時間07:00～19:00)擬黑夜、白天交叉光照，飼養房中室溫控制在(21±3)℃，相對濕度40%～60%[SYXK (滇) K2017-008]，讓樹鼩自由飲水和采食。每天打掃清理飼養籠具一次，預飼養后正常開始實驗喂養。本實驗方案研究經由實驗動物使用與管理委員會審批，通過中國科學院昆明動物研究所實驗動物倫理委員會批準(批準號：KPRC-2017006)。

1.2 主要試劑與儀器

飼料及處理：基礎樹鼩飼料來自昆明醫科大學實驗動物中心，按照美國營養學會嚙齒類AIN-93標準配方改制[2]：含粗蛋白23.1%，粗脂肪6%。制石飼料為基礎飼料加10%豬油，0.5、1.0、1.5%膽固醇分A、B、C三個劑量組合成小顆粒飼料。

戊巴比妥鈉(上海化學試劑公司，進口分裝，批號：F20140915)；Bouins液(自制：苦味酸飽和水溶液75 mL，甲醛25 mL，冰醋酸5 mL)；tween-20(濟寧中堅科技有限公司，批號：9005645)；低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)(批號：1E31-20 2016923)；高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)(批號：3K33-21 2016923)；甘油三酯(TG)(批號：7D74-21 2016423)；總膽固醇(TC)(批號：7D62-21 2016423)。雅培Ci16200全自動生化分析儀；徠卡RM2235型切片機；Olympus顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 指標采集

所有樹鼩在造模后測量每周的空腹體重。測量時必須空腹12 h，裝入保定袋稱凈體重；另外，分別于造模前空腹采股靜脈血1 mL、造模中每4周采股靜脈血1 mL，檢測空腹狀態下低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、甘油三酯(TG)及總膽固醇(TC)等生化指標。所有指標檢測在云南省第一人民醫院進行(雅培全自動生化分析儀Ci16200)。

1.3.2 取材

從第4、8周部分樹鼩采用3%戊巴比妥鈉腹腔注射安樂死，然后取材按消化道從上至下各段：先用生理鹽水沖洗干凈，再依次切下從食管取到直腸。將所有樣本用Bouins液改良后固定，固定液覆蓋樣本超出3 cm高，固定24 h，用80%、95%、100%的乙醇脫水、用二甲苯漸續透明，浸蠟(恒溫55℃)3 h包埋，取出蠟塊放冰箱固定，修蠟塊切片，按5 μm厚切，用毛筆挑起切片放于43℃水中展片，用鉻礬明膠貼在干凈的載玻片上，放于溫箱調于37℃烘片備用。取膽囊和膽汁常規病理切片檢測結石情況。

1.3.3 免疫組織化學方法

常規石蠟切片脫蠟復染。先消除內源性過氧化物酶的活性，切片放入37℃ 3% H2O2甲醇溶液孵育15 min，然后滴加山羊血清封閉液，置于室溫孵育20 min，意在封閉非特異性反應區。甩去多余液體，滴上一滴一抗50 μL(稀釋倍數為1∶50 SP抗血清)，置載玻片于室溫靜置1 h或4℃過夜。如在4℃過夜需要在37℃復溫45 min，PBS液沖洗3次，再滴加二抗45～50 μL(稀釋倍數1∶100羊抗兔IgG·抗血清)，靜置于37℃恒溫水浴鍋1 h。滴加0.05% tween-20。滴加顯色液DAB-H2O25～10 min，顯微鏡下觀察染色深淺，PBS液沖洗3次10 min，用蘇木精復染2 min，鹽酸酒精分化，自來水沖洗10～15 min，脫水、透明、封片、鏡檢。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 各組血脂測定結果

對照組與模型組樹鼩不同時間段血脂指標變化見表1。各組血脂測定結果顯示：模型組與對照組比較，第4周和第8周TC濃度升高差異有顯著性(P< 0.01)；模型組第8周與第4周比較差異無顯著性(P> 0.05)，說明模型組在第4周時血液總膽固醇含量已處于較高水平，繼續喂含高膽固醇的飼料并不能進一步增高血液總膽固醇濃度。模型組與對照組比較，第4周和第8周TG濃度升高差異有顯著性(P< 0.05)；模型組與對照組比較，第4周和第8周HDL-C降低差異有顯著性(P< 0.01)，LDL-C升高差異有顯著性(P< 0.01)。

2.2 樹鼩成活、成石情況

比較發現飼料含1.0%膽固醇飼養樹鼩成模較好，死亡率較低，結果見表2。

2.3 模型組與對照組膽囊的SP含量比較結果

用ABC免疫組織化學法，根據著色深淺，區別組織中SP含量；膽囊組織切片中細胞胞質內出現明顯的黃色顆粒，屬于SP蛋白陽性表達，無黃色顆粒是陰性。使用計算機圖像分析技術半定量檢測其陰、陽性蛋白表達的強弱，用平均光密度值大小表達強弱，密度值越大反映細胞內SP蛋白表達量越多；平均光密度值越低，膽囊組織SP蛋白表達結果越弱。結果見表3。

2.4 樹鼩膽囊膽固醇結石4～8周組織變化

經比較，選擇較好的組織圖片，如圖1所示。組織圖片顯示：對照組膽囊組織P物質表達出現較多； 4周模型B組膽囊內膜結構紊亂，有絮狀網形成，膽汁渾濁； 8周模型B組膽固醇晶體沉積，有積聚狀態即可行成核團框架石頭；模型B組膽囊組織P物質表達出現減少，結石形成。結果如圖1。

表1 樹鼩不同時間段血脂指標變化Table 1 Changes of blood lipid index in tree shrews in different time periods

注：與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

表2 不同劑量膽固醇飼養8周各組動物成模率、死亡率比較Table 2 Comparison of model success rates and mortality rates of tree shrews in each group after feeding for 8 weeks with different doses of cholesterol

表3 模型組與對照組膽囊的SP含量比較Table 3 Comparison of SP content in gallbladder between model groups and control group

注：與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

注：A： 4周模型B組膽囊(HE染色，× 40)；B：8周模型B組膽囊內膜(HE染色，× 40)；C：4周對照組膽囊內膜(HE染色，× 200)；D：8周模型B組膽囊內膜(HE染色，× 200)；E：4周模型B組晶體(HE染色，× 200)；F：8周模型B組晶體(HE染色，× 200)；G：4周對照組SP表達；H：4周模型C組SP表達；I：8周對照組SP表達；J：8周模型B組SP表達。圖1 不同時間膽囊內結構變化Note. A: Gallbladder at 4 weeks in model group B (HE staining, × 40); B: gallbladder endometrium at 8 weeks in model group B (HE staining, × 40); C: intima at 4 weeks in the control group (HE staining, × 200); D: endometrium at 8 weeks in model group B (HE staining, × 200); E: crystal at 4 weeks in model group B (HE staining, × 200); F: crystal at 8 weeks in model group B (HE staining, × 200). G: SP expression at 4 weeks in the control group; H: SP expression at 4 weeks in model group C; I: SP expression at 8 weeks in the control group; J: SP expression at 8 weeks in model group B.Figure 1 Changes in the structure of the gallbladder at different time

3 討論

高膽固醇飼料飼養樹鼩，經稱重觀察樹鼩體重增重并不明顯(數據未顯示)；第4周血清脂肪代謝指標與對照組比較差異有顯著性(P< 0.05)；采血后部分樹鼩出現精神萎靡，快速取材發現形成脂肪肝，膽囊內已形成晶體絮狀物。實驗表明含1.0%膽固醇的飼料飼喂樹鼩易制作膽石疾病模型。采用樹鼩建此模型比豚鼠、兔子與人類同源性更近，據資料通過基因組分析發現樹鼩在神經及免疫系統的分子信號通路與人類具有較高的同源性，在很多方面具有可用來替代靈長類實驗動物的遺傳基礎[3-4]。經實驗分析：樹鼩腸道P物質隨著膽固醇含量的增高出現了低表達。可能是因小腸蠕動傳輸速率減緩，十二指腸、空腸內P物質的含量明顯減少[5]。表明高膽固醇飼料對消化道平滑肌有強烈刺激作用，P物質的表達也隨刺激而產生變化，其受體可直接作用于縱行肌、環行肌引起收縮，增強結腸袋推進性運動；P物質表達降低時，膽囊收縮減慢，胃腸功能紊亂，胃腸運動功能障礙[6]。消化道黏膜缺血致缺氧損傷，缺血使炎性因子黏附腸道粘膜，產生內毒素和二胺氧化酶進入血液，導致部分靶器官感染，測定腸組織P物質表達出現減少，繼而也出現膽道感染，膽囊炎是促成脂肪肝、膽囊結石原因之一[7]。說明P物質的變化與胃腸消化道動力及脂肪肝之間有一定的相關性。

P物質是在分子水平上已測得的作用最強的內源性血管擴張肽，其消化道十二指腸表達減少，門脈高壓增加，P物質可能參與失代償性肝硬化患者血液動力學改變的發病機制[8]。樹鼩內環境的改變是導致門靜脈高壓和膽囊內膽汁淤積、膽固醇濃縮形成結石的主要原因。樹鼩采食高膽固醇食物導致磷脂、膽汁酸、膽固醇形成平衡的比例被打破，低密度脂蛋白(LDL)增多，膽固醇含量升高，膽固醇也隨之增加，導致膽汁中磷脂、膽鹽、膽固醇三者比例失調，中性脂肪在肝細胞內沉積，肝細胞功能受到影響，不能產生足夠多的膽汁酸，促使膽囊結石形成[6]。從而造成膽汁中的膽固醇也相應增加。正常情況下機體膽固醇能夠在膽汁中“溶解”。在體內可以形成“磷脂膽固醇泡”，也叫“轉運泡”，這是一種由膽固醇和磷脂一起組成的復合物[9]。當膽固醇含量相對增多，肝臟中的磷脂合成較少時，復合物的合成平衡被打破，多余的膽固醇就形成絮狀物或結晶，在膽汁中游離與“糖蛋白”凝聚在一起構建成結石的框架，結石的核心是磷酸鈣、膽紅素鈣聚集一起形成的，這樣逐漸形成膽固醇膽囊結石[10]。